生防解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)最新研究进展

李红晓, 张殿朋, 卢彩鸽, 赵洪新

(1.沈阳师范大学 化学与生命科学学院，辽宁 沈阳 100034；2.北京市农林科学院 植物保护环境保护研究所，北京 100097；3.浙江理工大学 生命科学学院 浙江省植物次生代谢重点实验室，浙江 杭州 310018)



生防解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)最新研究进展

李红晓1,2, 张殿朋2, 卢彩鸽2, 赵洪新1,3*

(1.沈阳师范大学 化学与生命科学学院，辽宁 沈阳 100034；2.北京市农林科学院 植物保护环境保护研究所，北京 100097；3.浙江理工大学 生命科学学院 浙江省植物次生代谢重点实验室，浙江 杭州 310018)

解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是与枯草芽胞杆菌相似，可产芽胞、革兰阳性(G+)、具有生防活性的益生细菌。其代谢过程中产生的抗菌物质种类多、抗菌谱广，其抗菌制剂或抗菌提取物具有无毒、无害、无残留、抑菌时效长等优点，可广泛应用于果蔬保鲜、果蔬生长期及采后微生物病害的生物防治，是极具开发价值的生防菌。本文从抗菌机理、抗性基因组成、基因工程菌构建、抗性产品开发及对微生物病害防治等几个方面，对解淀粉芽胞杆菌的研究及应用现状进行了归纳和总结，为其在农业生物工程中的规模化安全应用提供参考。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)；抑菌物质；生防效果；抗性基因

农作物微生物病害一直是困扰农业生产的大问题，是造成作物减产、影响经济效益的主要原因之一。长期以来，化学农药的使用是防治作物微生物病害的主要手段，但会导致农药残留，一方面给生态环境带来巨大影响，尤其微生态系统中的病原微生物产生抗药性，导致农药喷洒的浓度越来越高、用量越来越大，农药残留问题越来越严重。另一方面，残留农药通过食物链层级传递，给人类健康带来潜在的危险，已引起人们的高度关注[1]。因此，寻找绿色、环保、高效、安全的微生物病害防治手段，是农业生物工程领域的研究热点。 拮抗作用是指一类微生物产生的可以抑制或杀死它类微生物的作用，是微生物界普遍存在的现象，这为利用拮抗微生物来防治作物微生物病害，提供了极大的可能。经过几十年的努力，已有很多生防菌制剂面市，在生物防治中起到了积极作用。尽管如此，生防菌剂在所有植物病害防治中所占据的市场份额，仍然不足三分之一[2]，因此，生防菌剂具有巨大的开发空间，应用前景十分广阔。目前，研究和开发利用较多的生防细菌有芽胞杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、土壤放射杆菌(Agrobacterium)等。其中芽胞杆菌因其产生的抗菌活性物质丰富、种类较多、抑菌谱广、芽胞抗逆性强、活菌率高、抑制作用时间长等优点，且生物防治过程中与化学试剂有良好的相容性而备受关注[3]。除抗菌物质如降解酶、抗生素、氰化物等的直接作用外，绝大多数拮抗芽胞杆菌都是植物根际微生物(Rhizosphere microbe)，具有较强的植物根际定殖能力、抗逆能力和繁殖能力[4]。这不仅可以诱导作物抵抗逆境的能力，还可以通过汲取根际营养以及固定环境中的氮等元素促进植物生长，并通过磷转运蛋白TaPHT1.8和TaPHT1.10 转化环境中的化合态磷，通过系列生理作用为植物所利用，提高植物抵御农作物病害的能力[5]。解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)与枯草芽胞杆菌(B.subtillus)亲缘关系十分相近，其产生的抑菌物质具有种类多、抑菌谱广、抑菌活性强的特点，是近年来颇受关注的生防菌之一。Chen等[6]2007年公布了解淀粉芽胞杆菌 FBZ42 的全基因组测序，使得研究者在基因水平上对解淀粉芽胞杆菌的抑菌过程有了全面、深刻的认识，对多种次生代谢物的生产能力在分子水平上有了更深层次的了解，也促进了解淀粉芽胞杆菌在生物防治工程领域的利用。本文从解淀粉芽胞杆菌的发现、抑菌物质研究、抑菌功能基因、工程菌构建与开发应用等方面进行归纳总结，为解淀粉芽胞杆菌在生物防治领域的开发利用提供参考。

1 解淀粉芽胞杆菌的发现

解淀粉芽胞杆菌是1943年日本科学家Fukumoto发现的[7]，1967年Welker 在研究枯草芽胞杆菌降解淀粉和形成芽胞的异同时，首次将解淀粉芽胞杆菌从枯草芽胞杆菌中单列开来，因其具有很高的水解淀粉能力，命名为解淀粉芽胞杆菌[8]，直到1987年种的分类地位确立[9]。解淀粉芽胞杆菌隶属芽胞杆菌属(Bacillus)，菌落呈白色半透明，光滑湿润，杆状，革兰阳性(G+)。其有两个亚种：B.amyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciens和B.amyloliquefacienssubsp.plantarum，其中B.amyloliquefacienssubsp.plantarum亚种被普遍认为是具有植物促生长特性和产多种抑菌次级代谢产物的菌株[10]。解淀粉芽胞杆菌广泛分布于土壤、植物体内、果蔬表面、植物堆肥、健康动物粪便中等，尤其在植物内生菌和根际微生物群落中极易筛选出有拮抗活性的解淀粉芽胞杆菌[11]。该菌株因其具有植物促生长作用和代谢产物的生防活性，是极具潜力的生防菌。解淀粉芽胞杆菌不仅可以抑制植物病原菌的生长，还可以增加经济作物的果实数量和果实重量等[12]。研究表明，解淀粉芽胞杆菌生防菌制剂田间小试，具有抑菌谱广、抑菌效率高、抑菌时效长等特点，极具大面积开发应用潜力。

2 解淀粉芽胞杆菌的抗菌机理研究

2.1 解淀粉芽胞杆菌的抗菌作用

解淀粉芽胞杆菌抑菌谱广，作用明显，抗菌代谢物质丰富多样，主要体现在对真菌和细菌的抑制作用方面。其中对真菌的抑制作用主要表现在对灰葡萄孢、链格孢、丛梗孢、刺盘孢、尖镰孢、金黄壳囊孢、曲霉、青霉、毛霉、核盘菌和镰刀菌等病原真菌引起的果蔬病害的强抑制活性[11,13]。除实验室内对病原菌的间接实验外，Choiu等[14]证实解淀粉芽胞杆菌对离体果实和幼苗疫病同样有一定的防治效果，尤其是对Alternariacosmosa和A.patula解淀粉芽胞杆菌的抑制效果甚至明显高于其常用杀菌剂咪鲜胺和啶斑肟。对病原细菌的生防作用主要针对平菇褐斑菌、大白菜黑腐、假单胞菌属病原菌、李斯特菌、阴道加德纳菌、大肠埃希菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)[11,15]等。除抗菌作用外，Chen等的研究表明，从麦冬植物里分离得到的解淀粉芽胞杆菌产生的胞外多糖，具有抗肿瘤功效[16]；解淀粉芽胞杆菌脂肽提取物(BLE)可以诱导细胞凋亡并抑制人口腔鳞状细胞癌细胞的增殖；细菌培养滤液对松材线虫的致死率和虫体消解率最高达到100%[17]。Chiou等[14]研究表明，通过培养基优化和诱变育种可以增加其抗菌活性和生物酶产量，可见解淀粉芽胞杆菌的抑菌作用还有很大的提高空间。

2.2 解淀粉芽胞杆菌的抗菌物质

关于芽胞杆菌代谢过程中产生的抑菌物质，不同菌株的产物各不相同。综合归纳近年来有关芽胞杆菌的抗菌物质及抗菌作用(表1)，其中普遍认同的主要是抗菌脂肽、抗生素和水解酶类等。

表1 解淀粉芽胞杆菌抗菌物质及机理

2.3 解淀粉芽胞杆菌产生抗菌物质的相关基因

Chen 等于2007 年将解淀粉芽胞杆菌FZB42 全基因组序列公布[6]，到目前已有20 多株不同的解淀粉芽胞杆菌完成了全基因组测序。这为从基因水平研究解淀粉芽胞杆菌的抑菌机制提供了极大的方便，推动了从分子水平调控抗菌物质产生机理的研究。近年来有关解淀粉芽胞杆菌的基因操作、代谢工程改造方面取得的进展见表2。

表2 解淀粉芽胞杆菌抗菌基因

3 解淀粉芽胞杆菌生物防治基因工程菌的构建

20世纪40年代以来，随着青霉素的生产与发展，微生物菌种选育技术成为现代发酵工业的基础。为了降低发酵生产成本、提高发酵效率，研究人员采用了一系列的基因改良手段以期使其尽可能地发挥更大作用。1974年，波兰遗传学家Waclaw Szybalski提出的基因重组技术为此设想的实现奠定了基础，直到1991年提出的代谢工程将分子育种和生物过程系统工程方法相结合，对胞内代谢网络的诸多特征进行精确定量的分析，通过重组DNA 技术来赋予细胞理想的特性使工业微生物菌种改造取得了巨大的成果。赵延存等[33]利用60Co辐射诱变的解淀粉芽胞杆菌菌株处理的辣椒伤口腐烂面积下降64.4%；乔俊卿[2]将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽胞杆菌的bgl基因克隆到3 种不同的质粒载体中，分别转化到不同大肠埃希菌宿主中表达，重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶结合IPTG 和乳糖协同的诱导作用，在基础产酶培养基中最高总酶活为(1 883.3±45.8) U/mL；Cantwell等[28]将β-1,3-1,4-葡聚糖酶用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段与表达载体pET-30a(+)相连接后，构建了重组表达载体pETamy，导入大肠埃希菌中表达，其酶活是出发菌的3倍；用一株解淀粉芽胞杆菌中性蛋白酶结构基因npr构建质粒pPIC9K-npr，并转化到毕赤酵母中得到重组菌，酶活达9.17×103U/g，高于其他相关文献得到的结果。Tsuge等[34]将B.subtilis的伊枯草菌素A 操纵子基因片段通过感受态细胞转化到不含以上基因片段的B.subtilis基因组，然后再导入sfp基因和多向性调控基因degQ ，获得基因工程菌株伊枯草菌素A 的产量是原始菌株的7 倍，同时发现基因degQ 在其中起到关键的调控作用。

4 解淀粉芽胞杆菌抗性产品的开发

目前国内外均有基于芽胞杆菌为主要抑菌活性开发生防菌剂的发明专利。国外研究较早，且已将其成功应用于多个领域。美国食品药品管理局(FAD)已把某些种类的芽胞杆菌定为可直接饲喂动物的微生物(DFM)；美国解淀粉枯草芽胞杆菌变种获得美国环保局(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可；德国Abitep GmbH公司将解淀粉芽胞杆菌(FZB42)作为植物促生长剂，并成功开发为商品[35]；日本东京研究所研发的商品菌B.subtilisRB14 和美国Taensa 公司研发的商品菌B.amyloliquefaciensFZB42，主要用于防治农作物的枯萎病和根腐病[5]。而国内关于解淀粉芽胞杆菌的专利产品等主要应用于农业生产，且多集中在三种形式。①杀菌剂：南京农业大学[2]研制成一种防治香蕉枯萎病的杀菌剂，温室防效为52.37%～77.78%；黄亚丽[36]开发的微生物菌剂防治花生叶斑病。②生物菌肥：周波等[37]发明一种生物菌肥，有效防治马铃薯疮痂病。③可湿性粉剂：张荣胜[38]开发了噻枯唑复配可湿性杀菌粉剂，用于防治水稻细菌性条斑病或水稻白叶枯病；张海华[39]将其用于防治烟草、番茄和辣椒等作物的青枯病；徐超等[40]证实其对无花果、铁皮石斛果实的多种病原菌具有抑制作用。并且，因此而开发出了一系列抑菌产品，主要有枯草芽胞杆菌Bs-208杀菌剂、菜丰宁(枯草芽胞杆菌)、威绿达(绿色木霉为主, 毛壳菌、枯草芽胞杆菌为辅混配制成)、亚宝(枯草芽胞杆菌)、百抗(枯草芽胞杆菌)等生防制剂。

5 展 望

化学农药在农业病害防治过程中起到巨大的作用，但长期使用其负面效应也越来越突出。寻找和开发绿色、环保、安全、低成本的生物防治制剂，实现高效、低毒、无害化、无残留的生物预防和保鲜方法，具有重要现实意义。

解淀粉芽胞杆菌可产生多种抑菌活性物质，其分布广，抑菌产物丰富且抑菌谱广，代谢产物具有良好的离体和活体抑制活性，是一种极具生防潜力的菌株。随着分子生物学技术的发展，解淀粉芽胞杆菌的基因组测序和功能解析取得了巨大进展。这对解淀粉芽胞杆菌的开发应用提供了强有力的支撑。但有关该菌的抑菌作用机制、基因产物及毒理作用等方面的研究还需进一步完善，未来会有更多的以解淀粉芽胞杆菌为主要抗菌活性成分的生防菌剂被开发和应用。

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Funds Projecd:This article supported by Youth foundation of Lanzhou Jiaotong University(2014011)

Author profile：zhao mengmeng, female, associate professor, doctor in reading.

Research direction: Microbial physiology and biochemistry and its application. Tel: 0931-4938793，E-mail: zhaomm80@163.com

Draft accepted date:2015-06-02; Revision returned date:2015-07-03

The Latest Advances in Bio-ControlBacillusamyloliquefaciens

LI Hong-xiao1, 2, ZHANG Dian-peng2, LU Cai-ge2, ZHAO Hong-xin1,3

(1.Coll.ofChem. &LifeSci.,ShenyangNormalUni.,Shenyang110034; 2.Inst.ofPlant&Environ'tProtect'n,BeijingAcad.ofAgric. &Forest.Sci.,Beijing100097; 3.ZhejiangProv.KeyLab.ofPlantSecondaryMetabol. &Regul'n,Coll.ofLifeSci.,ZhejiangSci-TechUni.,Hangzhou310018)

Bacillusamyloliquefaciensis a strain similar toB.subtilis, a beneficial microbe that can produce spore, Gram-positive, and possessing biocontrolling activity. During its metabolism it produces antibiotic substance, a variety of antibiotic preparations or antibiotic extracts with broad antibiotic spectrum, non toxic, non harms, non residues, long effectiveness for a given period of time, and other advantages. It can be widely applied in keeping fruits and vegetables fresh, and in biocontrolling microbial pests during their growth and post-harvest. It is a very ideal biocontrolling microbe with the most developing value. In this paper the studies, the current application ofB.amyloliquefacienswere drawn and summarized from aspect of the antibiotic mechanism, the antibiotic gene component, the establishment of genetic engineering strain, the development of resistance products, the controlling against microbial pests, and other aspects, and accordingly to provide references for its large-scale safety application in agricultural bio-engineering.

Bacillusamyloliquefaciens; antibacterial substances; biocontrol effect; resistance gene

辽宁省科学公益基金项目(2014003020)；北京市农林科学院青年科研基金(QNJJ201317)；北京市优秀人才培养资助项目(2013D002020000005)

李红晓 女，硕士研究生。主要从事生物防治微生物研究。E-mail:18515344607@126.com

* 通讯作者。男，教授，硕士生导师。主要从事资源微生物的开发利用。E-mail:bxxbj2003@gmail.com

2015-10-15；

2015-11-06

Q939.9

A

1005-7021(2016)02-0087-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.015