重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼对肝癌细胞株HepG2的体外抑制作用

李璐璐，张秀，金萧萧，王彩莲，陈蓉

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 肿瘤科，江苏 南京 210009)



·论 著·

重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼对肝癌细胞株HepG2的体外抑制作用

李璐璐1，张秀1，金萧萧1，王彩莲2，陈蓉2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 肿瘤科，江苏 南京 210009)

目的：探讨重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼(sorafenib)体外对人肝癌细胞株HepG2增殖及凋亡的影响。方法:将重组人5型腺病毒H101和索拉非尼分成单用组及联合用药组，作用于HepG2细胞，另设不加药对照组。CCK-8法检测HepG2细胞存活率，流式细胞术及DAPI染色检测HepG2细胞凋亡。结果：重组人5型腺病毒H101及索拉非尼均可显著抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡；与重组人5型腺病毒H101或索拉非尼单用相比，两药联合对HepG2细胞增殖抑制及诱导凋亡作用更为显著(均P<0.05)。结论：重组人5型腺病毒H101、索拉非尼单用及联用均能体外抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡，且在特定索拉非尼浓度范围内两药联合存在协同作用。

肝细胞癌；重组人5型腺病毒H101；索拉非尼；协同作用

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是消化系统常见恶性肿瘤之一，居全球常见恶性肿瘤第5位，是恶性肿瘤相关性死亡的第3位危险因素[1]。索拉非尼是第一个能使晚期肝癌患者生存获益的靶向治疗药物，可用于治疗不能手术切除或远处转移的原发性肝细胞癌[2-3]，但其治疗晚期肝癌疗效有限且不良反应发生率高，仍迫切需要新的治疗手段提高肝癌的总体疗效。目前，溶瘤病毒抗肿瘤正在受到广泛关注。重组腺病毒H101是利用基因工程技术敲除了人5型腺病毒的E1B-55KD基因和E3区部分基因片段(78.3～85.8 μm)而获得的一种溶瘤腺病毒，其可选择性地在抑癌基因p53功能缺陷的肿瘤细胞中复制[4]。而E1B-55KD缺失的腺病毒在选择性地杀伤p53基因缺失型肝癌细胞的同时对p53基因野生型肝癌细胞杀伤效果较差[5]。本研究将重组人5型腺病毒H101与索拉非尼相联合，探讨两者对p53基因野生型肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人肝癌细胞株HepG2，购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.1.2 主要试剂与仪器 重组人5型腺病毒H101(上海三维生物技术有限公司)，索拉非尼(Apexbio公司，美国)以DMSO溶解，均-20 ℃保存；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液(Gibco公司，美国)；CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、DAPI试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；酶标仪(Tecan Infinite F50，瑞士)；流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 使用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养肝癌细胞株HepG2，每周传代2～3次。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖情况 将对数生长期HepG2细胞以5×103孔-1的密度接种于96孔板，各组设5个复孔，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养12 h后进行药物干预。(1) 单药干预：重组人5型腺病毒H101以不同感染复数(multiple of infection，MOI为0、10、100、200、500、1 000)处理HepG2细胞，分别继续培养24、48、72、96 h；索拉非尼以不同浓度(0、2、4、6、8、10 μmol·L-1)处理HepG2细胞，分别继续培养24、48、72 h。(2) 两药联合干预：分设索拉非尼单药组(sorafenib组)及重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼组(H+S组)。索拉非尼组各复孔加入含不同浓度索拉非尼的培养基使其终浓度分别为0、0.925、1.85、3.7、7.4、14.8、29.6 μmol·L-1；H+S组各复孔加入含重组人5型腺病毒H101的培养基使其MOI均为200，并加入索拉非尼使其终浓度分别为0、0.925、1.85、3.7、7.4、14.8、29.6 μmol·L-1，继续培养48 h。各复孔加入CCK-8试剂10 μl，培养箱内孵育2 h，酶标仪上测定450 nm波长的OD值，计算细胞存活率(cell viability)，并根据金氏公式计算q值，评价两药间相互作用。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 分设对照组(control组)、单药重组人5型腺病毒H101组(H101组)、单药索拉非尼组索拉非尼组、H+S组。将对数生长期HepG2细胞以2×105孔-1的密度接种于6孔板，12 h后进行药物干预：H101组加入含重组人5型腺病毒H101的培养基使其MOI为200，索拉非尼组加入含索拉非尼的培养基使其终浓度为7.4 μmol·L-1，H+S组加入相应感染复数的重组人5型腺病毒H101和相应浓度的索拉非尼，对照组加入相应体积含0.1%DMSO培养基。培养48 h后，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后离心收集细胞，并以结合液重悬，依次加入5 μl Annexin V-FITC及10 μl碘化丙啶染色液，混匀，室温避光孵育20 min，随即流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.2.4 DAPI染色观测细胞凋亡状态 实验分组及药物干预同上。分组处理的HepG2细胞培养48 h后，去除旧培养基，PBS冲洗1次，福尔马林固定30 min，PBS冲洗3次，室温下DAPI染色10 min，PBS冲洗净残余染液，以荧光显微镜紫外光激发下观测并拍照。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 重组人5型腺病毒H101及索拉非尼单药对HepG2细胞的增殖抑制作用

重组人5型腺病毒H101对HepG2细胞存在显著增殖抑制作用，且当MOI为200或更高时，细胞存活率无显著差异，MOI等于200为H101对HepG2细胞的最适感染复数(图1A)。索拉非尼亦可显著抑制HepG2细胞增殖，并呈剂量-时间依赖性(图1B)，经计算得其48hIC50为7.4μmol·L-1。

图1 CCK-8法检测重组人5型腺病毒H101及索拉非尼单药对HepG2细胞存活率影响

Fig 1 Effects of H101 or sorafenib on cell viability of HepG2 cells via CCK-8 assay

2.2 重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼对HepG2细胞的增殖抑制作用

固定重组人5型腺病毒H101感染复数为200、索拉非尼浓度为0～0.925 μmol·L-1时对HepG2细胞的毒性作用小，随浓度增加索拉非尼对HepG2细胞产生显著增殖抑制作用(P<0.05)。索拉非尼浓度为0～3.7 μmol·L-1时，单药索拉非尼组与联合组对HepG2细胞的增殖抑制作用存在显著差异(P<0.05)，且在此浓度范围内两药联合表现为协同作用。索拉非尼浓度达7.4 μmol·L-1时，两组细胞存活率无显著差异(图2)。

与阴性对照比较，aP<0.05；与索拉非尼组比较，bP<0.05

图2 CCK-8法检测重组人5型腺病毒H101与索拉非尼联合对HepG2细胞存活率影响

Fig 2 Effects of co-treatment of H101 and sorafenib on cell viability of HepG2 cells via CCK-8 assay

2.3 重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼对HepG2细胞凋亡情况影响

重组人5型腺病毒H101及索拉非尼单药或两药联合均能显著诱导HepG2细胞的凋亡，且两药联合较单药作用更显著(P<0.05，图3)。DAPI染色显示，荧光显微镜下，各给药组均出现细胞密度减低，细胞核浓集、边聚现象，且联合给药组的细胞凋亡现象更显著(图4)。

3 讨 论

目前肝癌仍无特效的治疗手段，外科手术及肝移植是肝癌的主要治疗方法，但仅15%肝癌患者可接受此治疗，且预后仍较差，中位生存期小于1年；其他传统治疗方式如射频消融、经动脉化学栓塞(TACE)、放射治疗、全身化疗等使肝癌患者生存获益均不显著，索拉非尼分子靶向治疗虽可一定程度提高肝癌患者总生存期，但疗效有限[6]。

溶瘤病毒疗法是指利用肿瘤细胞自身功能性基因的失活或缺失，使用可自主复制病毒靶向性感染并杀伤肿瘤细胞，而正常组织细胞免受破坏的抗肿瘤方式[7-8]。溶瘤病毒主要通过以下几方面发挥抗肿瘤作用:(1) 选择性感染并杀伤肿瘤细胞；(2) 破坏肿瘤血供；(3) 促进肿瘤相关抗原释放，激发机体的抗肿瘤免疫[7]。腺病毒具有能够感染分裂像和非分裂像细胞、对外源基因插入容量调节性强、不与宿主染色体整合及无内在致癌性的优点，使其成为溶瘤病毒抗肿瘤治疗中研究最多的病毒载体[9]。然而溶瘤病毒抗肿瘤亦有其限制因素，如血清细胞因子的中和、机体单核吞噬系统的清除隔离、由肿瘤供血血管外溢受限以及瘤内扩散效果差等[7]。另外，恶性肿瘤常伴柯萨奇-腺病毒受体表达的下降，使肿瘤细胞对腺病毒易感性降低，也是影响溶瘤腺病毒抗肿瘤的重要因素[10]。

重组人5型腺病毒H101是利用基因工程技术获得的溶瘤病毒。野生型人5型腺病毒的E1B55-KD基因产物通过抑制p53基因功能使其能在正常组织细胞中进行复制，敲除该区域后使重组人5型腺病毒H101选择性在p53基因功能缺陷的肿瘤细胞中复制；E3区的基因片段可以编码病毒死亡蛋白，去除后保证重组人5型腺病毒H101临床应用的安全性[4]。既往研究表明，重组人5型腺病毒H101对肝癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌等恶性肿瘤均有显著的抗肿瘤作用[11-15]。重组人5型腺病毒H101已被中国食品药品监督管理局批准用于临床头颈部恶性肿瘤的治疗。索拉非尼是一种口服多激酶抑制剂，具有双重抗肿瘤作用：一方面通过抑制Raf/MEK/ERK信号通路直接抑制肿瘤细胞生长，另一方面通过抑制血管内皮生长因子受体、血小板源生长因子受体、纤维母细胞生长因子受体阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞增殖和转移[2-3]。已有多项将溶瘤病毒与化疗、分子靶向治疗相结合治疗恶性肿瘤的体内外研究取得较好的抗肿瘤效果[11-12，16-17]。

与对照组比较，aP<0.05

图3 流式细胞术检测HepG2细胞凋亡

Fig 3 Detection of apoptosis in HepG2 cells by flow cytometry

图4 DAPI染色检测HepG2细胞凋亡(×400)

Fig 4 Detection of apoptosis in HepG2 cells by DAPI staining

本研究结果显示，重组人5型腺病毒H101、索拉非尼单用或两者联合均可显著抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡。在重组人5型腺病毒H101感染复数为200时，其细胞增殖抑制作用与更高感染复数时无显著差异，因此MOI等于200为其对HepG2细胞的最适感染复数。在索拉非尼浓度为0～3.7 μmol·L-1时，重组人5型腺病毒H101与索拉非尼联合可协同抑制HepG2细胞增殖(P<0.05)，其中浓度为0.925 μmol·L-1时，其单用细胞毒性作用较小(P>0.05)，但与重组人5型腺病毒H101联合对HepG2增殖可产生协同抑制作用，说明索拉非尼对重组人5型腺病毒H101细胞杀伤作用存在促进效应。在索拉非尼浓度达7.4 μmol·L-1时，重组人5型腺病毒H101作用逐渐不明显，索拉非尼成为抑制细胞增殖主要因素。因此，重组人5型腺病毒H101仅与特定浓度范围内索拉非尼联合对HepG2细胞增殖起协同抑制作用。

综上所述，重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼治疗肝癌是一种有效的抗肿瘤方式，但索拉非尼浓度应控制在合适范围内，否则联合治疗意义降低。本实验结果可为溶瘤腺病毒联合分子靶向药物治疗肝癌提供相关依据，并为临床上肝癌的治疗提供新的治疗思路，但重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼联合对不同细胞株的杀伤效果及相关机制仍须进一步研究。

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Inhibitory effect of recombinant adenovirus H101 combined with sorafenib against hepatocellular carcinoma HepG2 cellsinvitro

LI Lu-lu1，ZHANG Xiu1，JIN Xiao-xiao1，WANG Cai-lian2，CHEN Rong2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；2.DepartmentofOncology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective:To investigate the inhibitory effect of recombinant adenovirus H101 combined with sorafenib on the proliferation and apoptosis of hepatocellular cell line HepG2invitro.Methods:HepG2 cells were treated with H101，sorafenib alone and in combination with the untreated cells used as control.The proliferation inhibition effect was determined using CCK-8 assay.Apoptosis was analyzed by flow cytometry and 4，6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining.Results:Oncolytic adenovirus H101 and sorafenib used alone or together both inhibited the proliferation of HepG2 cells and induced cell apoptosis.Compared with H101 or sorafenib alone，co-treatment led to a stronger antitumor effect in HepG2 cells.Conclusion:Oncolytic adenovirus H101 and sorafenib show a synergistic effect in inhibiting the proliferation and inducing apoptosis of HepG2 cells.

hepatocellular carcinoma; recombinant adenovirus H101; sorafenib; synergistic effect

2016-02-23

2016-04-25

国家自然科学青年基金资助项目(8121131)

李璐璐(1990-)，女，安徽淮北人，在读硕士研究生。E-mail：836874736@qq.com

王彩莲 E-mail:wangcailian65@hotmail.com; 陈蓉 E-mail:rr1977@163.com

李璐璐，张秀，金萧萧，等.重组人5型腺病毒H101联合索拉非尼对肝癌细胞株HepG2的体外抑制作用[J].东南大学学报：医学版，2016，35(5)：673-677.

R735.7

A

1671-6264(2016)05-0673-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．006