IGF信号轴在卵巢癌干细胞样细胞增殖状态转换及预防卵巢癌复发中的作用

郭欣，张科科，刘燕，徐慧，蔡云朗

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 妇产科，江苏 南京 210009)



·论 著·

IGF信号轴在卵巢癌干细胞样细胞增殖状态转换及预防卵巢癌复发中的作用

郭欣1，张科科1，刘燕1，徐慧1，蔡云朗2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 妇产科，江苏 南京 210009)

目的:探究胰岛素样生长因子(IGF)信号轴在促进卵巢癌干细胞样细胞增殖和抗凋亡中的作用，探讨基于IGF信号轴的IGF-1R抑制剂的靶向治疗和寻求降低卵巢癌化疗后复发的可能途径。方法：采用CD117+CD44+A2780卵巢癌细胞株，使用免疫细胞化学的方法检测IGF信号轴中IGF-1、IGF-2和IGF-1R在CD117+CD44+A2780细胞中的表达；利用MTT法检测IGF-1对CD117+CD44+A2780细胞的促增殖活性，配制IGF-1的质量浓度分别为10、25、40、55 ng·ml-1,另设空白对照，从中筛选出加入外源IGF-1的适宜质量浓度用于后续实验中；再将实验分为3组，即IGF-1刺激组、NVP抑制组和空白组。通过流式细胞术检测3组细胞在药物处理48 h后的细胞周期分布和凋亡率情况。结果：IGF信号轴组件IGF-1、IGF-2和IGF-1R均表达在CD117+CD44+A2780细胞的细胞膜上和细胞质中；MTT检测发现当外源IGF-1质量浓度为40 ng·ml-1时对CD117+CD44+A2780细胞的促分裂增殖作用最明显；IGF-1刺激组较空白组增殖明显活跃，凋亡率降低(P<0.05)；NVP抑制组较空白组增殖明显减少，凋亡率增高(P<0.05)。结论：IGF信号轴与卵巢癌化疗后的复发密切相关，IGF-1在卵巢癌干细胞样细胞转换增殖状态和对抗凋亡中发挥着重要作用；NVP阻断IGF-1R的作用可有效抑制卵巢癌干细胞样细胞从休眠状态启动分裂增殖；IGF信号轴组件可作为卵巢癌治疗及化疗后预防复发的靶点。

胰岛素样生长因子-1；胰岛素样生长因子-1受体；NVP-AEW541；卵巢癌干细胞样细胞

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其早中期无特异性的临床表现，明显影响了对卵巢癌的早期诊断，多数患者错失了治疗的时机。早期诊断、尽量减灭肿瘤细胞及防止复发是治疗卵巢癌的关键。肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)是一类具有较强耐药性细胞，是肿瘤侵袭转移、促血管生成和复发的根源。在临床治疗中，经过理想的肿瘤细胞减灭术和足量合理的化疗后，绝大部分的肿瘤细胞被杀死，残留癌细胞中的CSCs处于一种静止状态，不表现出活跃的分裂增殖现象，患者会出现相对较长的缓解期。但临床化疗可使肿瘤干细胞浓集，当受到适当的刺激可再次进入活跃增殖状态[1]。CSCs逸出静止期进入增殖状态导致完全缓解期后肿瘤的复发，并且复发的肿瘤相比初发肿瘤具有更强的耐药性和侵袭性。因此，探究肿瘤干细胞的增殖凋亡及与其增殖状态转换相关的因素是肿瘤治疗的关键。

胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)可特异性结合胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor receptor，IGF-1R)。IGF-1R是一种异源二聚体跨膜蛋白酪氨酸激酶，与配体IGF-1、IGF-2结合后使IGF-1R的酪氨酸残基磷酸化，激活多条信号通路，调节相关基因表达，参与细胞周期转换，促进肿瘤细胞增殖及抗凋亡。IGF信号轴在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用，并与肿瘤的复发密切相关。因此，研究IGF轴在CSCs增殖状态转换中的作用，对于寻找新的化疗药物靶点、提高肿瘤细胞的化疗敏感性具有重要意义。本次实验选用具有卵巢癌干细胞特性的CD117+CD44+A2780细胞株[2]，进一步探究IGF信号轴促进卵巢癌干细胞样细胞逸出静止期、抗凋亡的机制，探讨降低卵巢癌复发率的可能途径。

1 试剂与方法

1.1 主要试剂

鼠抗IGF-1单克隆抗体、鼠抗IGF-2单克隆抗体、鼠抗IGF-1R多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。NVP-AEW541(以下简称NVP)是吡咯并嘧啶类化合物，作为IGF-1R的抑制剂，阻断胞内信号转导，购自美国Cayman生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用新鲜无血清培养基培养CD117+CD44+A2780细胞，将细胞置37 ℃含有体积分数5% CO2的细胞培养箱中4～5 d传代1次。

1.2.2 免疫细胞化学法测定IGF轴 取对数生长期的CD117+CD44+A2780细胞，完全培养基重悬，并调整细胞密度为5×105个细胞，接种于6孔板上，培养过夜，待细胞贴壁之后更换为新鲜无血清培养基，48 h后终止培养。浸入4%的多聚甲醛固定液中30 min，PBS浸洗3 min×3次；每张切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室温(15～25 ℃)封闭10 min，PBS浸洗3次；滴加即用型山羊血清50～100 μl，室温孵育20 min；滴加一抗(1∶200稀释)50～100 μl，于37 ℃湿盒孵育2 h，PBS浸洗3次；滴加增强剂50 μl，室温湿盒孵育30 min，PBS浸洗3次；滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体50 μl，室温37 ℃，孵育30 min，PBS浸洗3次。每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液显色，终止显色后将切片放入苏木素染液，染色10 min，用蒸馏水冲洗干净；脱水封片，光学显微镜下观察细胞中IGF1、IGF2、IGF-1R的表达情况，取3个区域拍照保存。

1.2.3 筛选外源IGF-1适宜浓度 将细胞以每孔5×105个细胞的密度接种于24孔板上，完全培养基孵育过夜，更换为新鲜无血清培养基，继续培养12 h，加入IGF-1，质量浓度分别为10、25、40、55 ng·ml-1。IGF-1作用24 h后倒置显微镜下进行细胞计数。

1.2.4 流式细胞术分析细胞周期 取对数生长期的细胞，接种于6孔板上，根据不同的处理方式将细胞分为未加IGF-1的空白组、加IGF-1的刺激组和加NVP的抑制组(10 μmol·L-1)。其中IGF-1刺激组的IGF-1质量浓度根据1.2.3的结果进行选择。药物作用48 h后各组离心收集5×105个细胞，体积分数70%乙醇固定2 h，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液；加100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min；再加入400 μl PI染色混匀，4 ℃避光30 min；上机检测，记录激发波长488 nm处红色荧光。

1.2.5 流式细胞术分析细胞凋亡 将细胞接种于6孔板上，按同样的方法分组，药物作用48 h后各组离心收集5×105个细胞，加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，再加入5 μl Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15 min，用流式细胞术检测细胞凋亡的情况。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行方差分析。数据以均数±标准差表示，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 CD117+CD44+A2780细胞IGF-1、IGF-2、IGF-1R的表达

免疫细胞化学法结果显示，IGF-1、IGF-2、IGF-1R在CD117+CD44+A2780细胞的细胞膜和细胞质上均有表达，呈棕色颗粒(图1)。

图1 免疫细胞化学法检测IGF-1、IGF-2、IGF-1R在CD117+CD44+A2780细胞中的表达(×400)

2.2 筛选外源IGF-1的适宜浓度

加入不同质量浓度的IGF-1，通过细胞计数提示低浓度的IGF-1即可促进细胞增殖，并随着浓度的增加和培养时间的延长，促进细胞增殖的作用就越强。当IGF-1的质量浓度达到40 ng·ml-1时，与空白组和25 ng·ml-1IGF-1刺激组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。当IGF-1的质量浓度增加至55 ng·ml-1时，与空白组间细胞增殖的差异亦有统计学意义(P<0.05)，但与40 ng·ml-1IGF-1刺激组组间的差异无统计学意义(P>0.05)，所以IGF-1刺激组加入的外源IGF-1质量浓度选用40 ng·ml-1，见表1。

2.3 CD117+CD44+A2780细胞的周期和凋亡

细胞周期的结果显示，IGF-1刺激组与空白组相比，IGF-1刺激组G1期的细胞明显减少(P<0.05)，S期的细胞显著增加(P<0.05)，G2期的细胞明显减少(P<0.05)；NVP抑制组与空白组相比，G1期的细胞明显减少(P<0.05)，S期的细胞显著增加(P<0.05)，G2期的细胞明显增加(P<0.05)。见表2、图2。

表1 外源IGF-1对CD117+CD44+A2780细胞的促增殖作用

组 别细胞计数/(×105)OD值10ng·ml-1IGF-1组2.50±0.06a0.420±0.04a25ng·ml-1IGF-1组3.13±0.05a0.479±0.08a40ng·ml-1IGF-1组3.89±0.17a0.563±0.05a55ng·ml-1IGF-1组3.92±0.25a0.567±0.15a空白对照组2.20±0.270.327±0.08

与空白对照组相比，aP<0.05

表2 CD117+CD44+A2780细胞周期分布

组 别nG1期S期G2期IGF-1刺激组836.19±1.30a56.51±1.45a7.30±0.55a空白对照852.49±0.3737.85±0.569.67±0.63NVP抑制组849.03±0.70ab40.64±0.65ab10.33±0.37ab

与空白组相比,aP<0.05; 与IGF-1刺激组相比,bP<0.05

图2 流式细胞术检测细胞周期

细胞凋亡的结果显示，随着时间延长CD117+CD44+A2780细胞在48 h的凋亡率空白组和IGF-1刺激组分别为(8.38±0.25)%、(6.53±0.36)%，差异有统计学意义(P<0.05)；NVP抑制组的凋亡率为(32.79±0.34)%，与空白组和IGF-1刺激组的相比差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 流式细胞术检测细胞凋亡

3 讨 论

IGF轴组件表达于正常的卵巢上皮和卵巢上皮性癌组织，促进细胞有丝分裂、分化及凋亡。越来越多的研究表明IGF信号轴与癌变有关[3]，肿瘤组织中IGF-1的含量可作为卵巢癌进展相关的独立因素，IGF轴在调节卵巢癌肿瘤的增殖和生长中起着关键作用[4-5]，并且在一定范围内呈剂量依赖性。目前研究已经证实IGF-1R在多种肿瘤中过表达，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和结肠癌等，血浆中IGF-1的含量与患乳腺癌、前列腺癌和肺癌的风险相关，且IGF-1R的表达量可预示乳腺癌的结果[6-8]。进一步研究表明在肝癌、结肠癌、胰腺癌及膀胱癌的肿瘤组织中降低IGF-1R的表达量，可抑制肿瘤细胞生长[9-11]。IGF轴的作用依赖于IGF-1和IGF-1R结合，不仅促进细胞合成分泌IGF-1和IGF-2，而且存在IGF的自分泌调节，促使细胞合成更多的IGF-1R，IGF-1R表达量的增加同时会促进细胞分泌更多的IGF-1和IGF-2[12]。IGF-1、IGF-2与IGF-1R特异性地结合后，其激活的通路主要有丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt-1)途径，起主要作用的是PI3K/AKT通路[13]。PI3K/AKT信号通路作为一条经典的生物学通路，参与信号转导，传递生长因子，调节细胞的生长、增殖和凋亡。PI3K/AKT信号转导通路的激活导致其下游细胞周期蛋白B1(CyclinB1)的异常高表达，CyclinB1过度表达可促使细胞的G2/M期转换，导致细胞的增生失控和恶性转换。

本实验用不同质量浓度的外源IGF-1作用于细胞，在低质量浓度时即可发挥促增殖的作用，在一定范围内增加质量浓度和延长作用时间，IGF-1的促增殖效果也会增强。IGF-1作用48 h后，CD117+CD44+A2780细胞活跃增殖。肿瘤干细胞样细胞增殖明显时致肿瘤复发临床缓解期结束。复发瘤较初发瘤普遍具有更强的耐药性，阻断由CSCs增殖状态转换导致的肿瘤复发是目前针对CSCs肿瘤化疗的新策略。IGF-1、IGF-2发挥作用需要通过IGF-1R受体，对于IGF-1R的靶向治疗可能会延长患者的完全缓解期，阻断CSCs逸出静止期，降低肿瘤复发率。采用针对IGF轴的阻断剂如IGF-1R的单克隆抗体、配体抗体或酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)辅助化疗可增强化疗效果。针对IGF-1R的单克隆抗体和TKIs进行的大量在体实验结果并不统一[14]，可能与IGF-1R阻断剂在体内不能维持IGF-1R的下调或对PI3K-AKT通路的抑制有关，提示肿瘤微环境对于这些因子的作用效果起到重要作用。

IGF-1R在体内外均可有抗凋亡的作用，且IGF-1R表达率高的细胞其生存率也就越高[15]。NVP不仅阻断胞内信号传递，明显减弱活化AKT的抗凋亡作用，还可逆转肿瘤细胞表型。在临床缓解期，CSCs可以长期存在，与IGF-1的抗凋亡作用有关。NVP抑制IGF-1R后CD117+CD44+A2780细胞显著凋亡，表示阻断IGF-1R的作用后，卵巢癌干细胞样细胞抗凋亡的机制被破坏，凋亡率增加，减低肿瘤复发率。

综上所述，IGF信号轴在阻断肿瘤干细胞增殖状态转换、抗凋亡和抑制肿瘤复发中发挥着关键作用，已成为治疗肿瘤的特异性靶点。近年来，针对IGF信号轴各组件的抑制剂已是抗肿瘤研究的热点和难点，传统化疗药物和IGF-1R抑制剂联用可增强化疗效果。探究针对IGF-1R的靶向药物，为肿瘤干细胞的治疗提供新的方案，将具有重要的临床意义。

[1] BAST R C，Jr MARKMAN M.Chemotherapy：a new standard combination for recurrent ovarian cancer？[J].Nat Rev Clin Oncol，2010，7(10):559-560.

[2] BURGOS-OJEDA D，RUEDA B,RBUCKANOVICH R J.Ovarian cancer stem cell markers：prognostic and therapeutic implications[J].Cancer Lett，2012，322(1):1-7.

[3] BEAUCHAMP M C，YASMEEN A，KNAFO A，et al.Targeting insulin and insulin-like growth factor pathways in epithelial ovarian cancer[J].J Oncol，2010，2010：257058.

[4] JIN M，BUCK EMULVIHILL M J.Modulation of insulin-like growth factor-1 receptor and its signaling network for the treatment of cancer：current status and future perspectives[J].Oncol Rev，2013，7(1):e3.

[5] BROKAW J，KATSAROS D A，LU L，et al.IGF-I in epithelial ovarian cancer and its role in disease progression[J].Growth Factors，2007，25(5):346-354.

[6] DOUGLAS J B，SILVERMAN D T，POLLAK M N，et al.Serum IGF-I，IGF-II，IGFBP-3，and IGF-I/IGFBP-3 molar ratio and risk of pancreatic cancer in the prostate，lung，colorectal，and ovarian cancer screening trial[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19(9):2298-2306.

[7] KURODA Y，KATO-KOGOE N，TASAKI E，et al.Suppressive effect of membrane-permeable peptides derived from autophosphorylation sites of the IGF-1 receptor on breast cancer cells[J].Eur J Pharmacol，2015，765：24-33.

[8] SLOMIANY M G，BLACK L A，KIBBEY M M，et al.Insulin-like growth factor-1 receptor and ligand targeting in head and neck squamous cell carcinoma[J].Cancer Lett，2007，248(2):269-279.

[9] SHUKLA S，GUPTA S.Apigenin suppresses insulin-like growth factor I receptor signaling in human prostate cancer：aninvitroandinvivostudy[J].Mol Carcinog，2009，48(3):243-252.

[10] TOMIZAWA M.Insulin-like growth factor-I receptor in proliferation and motility of pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol，2010，16(15):1854.

[11] VANAMALA J，REDDIVARI L，RADHAKRISHNAN S，et al.Resveratrol suppresses IGF-1 induced human colon cancer cell proliferation and elevates apoptosis via suppression of IGF-1R/Wnt and activation of p53 signaling pathways[J].BMC Cancer，2010，10：238.

[12] SMITH T J.Insulin-like growth factor-I regulation of immune function：a potential therapeutic target in autoimmune diseases？[J].Pharmacol Rev，2010，62(2):199-236.

[13] GALLAGHER E J,LEROITH D.The proliferating role of insulin and insulin-like growth factors in cancer[J].Trends Endocrinol Metab，2010，21(10):610-618.

[14] FLEUREN E D，VERSLEIJEN-JONKERS Y M，van de LUIJTGAARDEN A C，et al.Predicting IGF-1R therapy response in bone sarcomas：immuno-SPECT imaging with radiolabeled R1507[J].Clin Cancer Res，2011，17(24):7693-7703.

[15] FARHANA L，DAWSON M I，DAS J K，et al.Adamantyl retinoid-related molecules induce apoptosis in pancreatic cancer cells by inhibiting IGF-1R and Wnt/beta-catenin pathways[J].J Oncol，2012，2012：796729．

The role of IGF signal axis in proliferation transformation of ovarian cancer stem cell-like cells and in prevention of recurrent ovarian cancer

GUO Xin1，ZHANG Ke-ke1，LIU Yan1，XU Hui1，CAI Yun-lang2

(1.MedicalCollege，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To explore the role of IGF signal axis in promoting cell proliferation and anti-apoptosis of CD117+CD44+A2780，the ovarian cancer stem cell-like cells，discussing the targeting therapy based on IGF signal axis of IGF-1R and looking for possible ways to reduce the recurrence of ovarian cancer after chemotherapy.Materials and Methods： This experiment used CD117+CD44+A2780 ovarian cancer cell line，the expression of IGF-1，IGF-2 and IGF-1R of IGF signal axis in CD117+CD44+A2780 were detected by immune histochemical method; cells proliferation which was promoted by IGF-1 was measured by MTT assay in CD117+CD44+A2780，the concentration of IGF-1 was respectively 10，25，40，55 ng·ml-1and blank group.The suitable concentration of IGF-1 was selected and used in subsequent experiment; then the experiment was divided into three group： IGF-1 stimulate group，NVP inhibit group and blank group，the cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry after 48 h drug treatment.Results： IGF-1，IGF-2 and IGF-1R of IGF signal axis expressed in CD117+CD44+A2780’s cell membrane and cytoplasm; MTT test experimented on CD117+CD44+A2780 selected the suitable concentration of the four group of exogenous IGF-1，with a concentration of 40 ng·ml-1obviously promoting the proliferation; flow cytometry showed more active proliferation and a decreased apoptosis rate in IGF-1 stimulating group compared with the blank group(P<0.05); NVP inhibiting group，compared with blank group，inhibited proliferation and increased apoptosis rate(P<0.05).Conclusion： IGF signal axis has close relationship with the recurrence of ovarian cancer after chemotherapy; IGF-1 plays an important role in transforming the state of proliferation and anti-apoptosis; NVP can block the effect of IGF-1，stop ovarian cancer stem cell-like cells transforming from quiescent state to growth state; IGF axis can be used as target proteins in ovarian cancer treatment and prevention of recurrence after chemotherapy．

insulin-like growth factor-1；insulin-like growth factor-1 receptor；NVP-AEW541；ovarian cancer stem cell-like cells

2016-03-01

2016-05-09

郭欣(1991-)，女，山东聊城人，在读硕士研究生。E-mail：15905172950@163.com

蔡云朗 E-mail：ylseu63@sohu.com

郭欣，张科科，刘燕，等.IGF信号轴在卵巢癌干细胞样细胞增殖状态转换及预防卵巢癌复发中的作用[J].东南大学学报：医学版，2016，35(5)：736-741.

R737.31

A

1671-6264(2016)05-0736-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．019