USP22、FoxM1在结直肠癌中的表达研究

张琳 郭志琴 袁琳娜 温晓伟 王振 张怡 汪静宇 邬万新

USP22、FoxM1在结直肠癌中的表达研究

张琳 郭志琴 袁琳娜 温晓伟 王振 张怡 汪静宇 邬万新

目的 探讨去泛素酶基因（USP22）和叉头框M1基因（FoxM1）表达在结直肠癌发生、发展中的作用，以及与患者临床病理特征的关系。方法 选取行手术切除的结直肠癌组织标本120例和正常结直肠黏膜组织标本32例；采用免疫组织化学EnVision二步法和Western blot检测结直肠癌组织及相应癌旁正常组织中USP22、FoxM1及Wnt/β-catenin通路相关蛋白（β-catenin、LEF/TCF、c-myc）的表达。 结果 结直肠癌组织中USP22、FoxM1的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织（均P＜0.05）。结直肠癌组织中USP22、FoxM1、β-catenin、LEF/TCF、c-myc蛋白的表达水平均明显高于癌旁正常组织（均P＜0.05）。结直肠癌组织中USP22、FoxM1表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、肝脏转移及Duke's分期均有关（均P＜0.05）；且USP22/FoxM1共表达与肿瘤淋巴结转移、肝脏转移及Duke's分期亦均有关（均P＜0.05）。结论 结直肠癌组织中USP22、FoxM1的异常高表达可能参与了结直肠癌的发生、发展过程，且两者具有协同作用。

结直肠癌 去泛素酶基因 叉头框M1 临床病理特征

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，在我国发病率位于恶性肿瘤的第3位，严重危害人类健康。分子靶向治疗凭借高效、低毒的优势已成为抗肿瘤治疗的发展趋势，寻找分子靶向治疗的潜在靶点是目前研究的热点。去泛素酶基因（USP22）是新发现的去泛素化酶基因家族中一员，通过去泛素化修饰作用切断泛素链与底物蛋白之间的连接，从而发挥生物学功能，包括调控细胞周期、调节端粒动态平衡等。叉头框M1基因（FoxM1）通过与其下游靶基因的相互作用，在细胞增殖、分化、凋亡等信号通路的调控中发挥作用。本研究通过检测结直肠癌组织中USP22、FoxM1的表达情况，探讨两者在结直肠癌发生、发展过程中的可能作用机制及两者的相关性，以期为临床寻找新的结直肠癌治疗及判断预后方法提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 组织标本 选取2012年1月至2013年12月在本院行手术切除并经病理学检查证实为结直肠癌的组织标本120例。患者术前均未行放、化疗，其中男76例，女44例；年龄27～88（53.6±9.4）岁。肿瘤分期（Duke’s分期）A期29例，B期39例，C期36例，D期16例；肿瘤高分化39例，中分化53例，低分化28例；有淋巴结转移51例，无淋巴结转移69例；有肝脏转移49例，无肝脏转移71例。同时选取32例患者对应正常结直肠黏膜组织标本（取自癌旁＞5cm处）作为对照。标本均经4%中性甲醛固定、石蜡包埋、切片和HE染色。

1.2 主要试剂 兔抗人USP22多克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗人FoxM1抗体购自美国Santa Cruz Biotech公司；小鼠抗人β-catenin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠抗人β-actin、LEF/TCF、c-myc抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗小鼠IgG均购自美国Sigma公司；ECL购自美国Pierce公司；免疫组织化学二抗显示系统Real EnVision K5007购自杭州协博医药科技有限公司。

1.3 免疫组织化学染色 组织切片置于68℃烘箱中烘片2h，依次将载玻片置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇，在各溶液中放置5min后进行脱蜡，缓速水流冲洗载玻片10min，浸入pH 7.4的PBS中5min×3次，加入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），微波炉中高火档加热5min，解冻档解冻20min进行抗原修复，自然冷却20min，浸入PBS中5min×3次，3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶6min，PBS浸泡5 min×3次，滴加一抗USP22（1∶200）、FoxM1（1∶50），用PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜，次日PBS浸泡5min×3次，二抗显示采用Real EnVision K5007（按试剂盒说明书）进行免疫组织化学染色，复染、脱水、透明、封片。

1.4 结果判定 根据切片中阳性细胞比例和细胞着色强度进行结果判定[1-2]，细胞内出现棕黄色或棕褐色颗粒判定为阳性，由2位高级职称病理科医师在双盲条件下读片。400倍光学显微镜下随机选择5个视野，每视野着色细胞比例0%计0分，≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～70%计3分，≥71%计4分。着色强度无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。两项计分相乘得分＜5分为表达阴性，≥5分为表达阳性。

1.5 Western blot检测蛋白表达 随机选取3对结直肠癌组织及癌旁正常组织用蛋白裂解液提取蛋白，检测USP22、FoxM1及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（βcatenin、LEF/TCF、c-myc）表达。蛋白定量后进行SDSPAGE凝胶电泳、转膜及蛋白染色，用含10%脱脂奶粉的TBST室温封闭2h，一抗（USP22 1∶1 000；FoxM1 1∶200；β-catenin 1∶250；β-actin 1∶1 000；LEF/TCF 1∶250； c-myc 1∶250）4℃孵育过夜，次日室温恢复1h后TBST洗膜10min×3次，HRP偶联的二抗（1∶1 000）室温孵育45min，TBST洗膜10min×3次，ECL显色并分析，以与β-actin的灰度比值为蛋白相对表达水平。

1.6 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件；计量资料以表示，两组比较采用t检验；计数资料以构成比表示，两组比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 结直肠癌、癌旁正常组织中USP22、FoxM1表达情况比较 见图1、表1。

图1 结直肠癌、癌旁正常组织中USP22、FoxM1表达情况比较（a：癌旁正常组织；b：结直肠癌组织；EnVision法，×100）

表1 结直肠癌、癌旁正常组织中USP22、FoxM1表达情况比较[例（%）]

由图1可见，结直肠癌组织中USP22、FoxM1均主要表达于细胞核，而癌旁正常组织中均不表达或弱表达。由表1可见，结直肠癌组织中USP22、FoxM1阳性表达率均高于癌旁正常组织（均P＜0.05）。

2.2 结直肠癌、癌旁正常组织中USP22、FoxM1及Wnt/ β-catenin信号通路相关蛋白表达情况比较 见图2、表2。

由图2、表2可见，结直肠癌组织中USP22、FoxM1、β-catenin、LEF/TCF、c-myc蛋白表达水平均高于癌旁正常组织（均P＜0.05）。

2.3 结直肠癌组织中USP22、FoxM1表达与患者临床病理特征的关系 见表3。

图2 结直肠癌、癌旁正常组织中USP22、FoxM1及Wnt/βcatenin信号通路相关蛋白表达情况比较（C：结直肠癌组织；N：癌旁正常组织）

表2 结直肠癌、癌旁正常组织中USP22、FoxM1及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平比较

表3 结直肠癌组织中USP22、FoxM1表达与患者临床病理特征的关系[例（%）]

由表3可见，结直肠癌组织中USP22、FoxM1表达与患者性别、年龄均无关（均P＞0.05），而与肿瘤分化程度、淋巴结转移、肝脏转移和Duke’s分期均有关（均P＜0.05）。同时，USP22/FoxM1共表达与肿瘤淋巴结转移、肝脏转移和Duke’s分期亦均有关（均P＜0.05）。

3 讨论

USP22定位于人类17号染色体，由14个外显子构成，其开放阅读框由1 578个碱基组成，编码着525个氨基酸。USP22通过调控多种基因的转录发挥生物学功能。研究发现，USP22在胃癌组织中高表达[3]；USP22在乳腺癌中的阳性表达率比在乳腺纤维腺瘤和正常乳房组织中高，且与是否发生淋巴结转移、Her-2和Ki-67的表达、疾病复发率密切相关；USP22在结直肠癌中异常表达或可促进癌细胞肝脏转移，且患者预后较差[4-5]。至今，USP22的异常表达和潜在机制已有初步研究。干扰肿瘤细胞中USP22的表达可以阻滞细胞周期于G1期，抑制细胞增殖，导致细胞凋亡[6-7]。另外，USP22利用去泛素化酶调节蛋白质的功能，促进细胞增殖[8]。USP22是致命肿瘤表型的1个关键启动子，其作用是调节核受体和致癌信号[9]。

FoxM1基因位于染色体12p13.3末端着丝粒区域，包含10个外显子，是1种增殖相关的转录因子，仅在具有分裂活性的细胞中表达，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等过程。FoxM1在增殖细胞中广泛表达，并且在各种恶性肿瘤中显著上调，包括胃癌、非小细胞型肺癌、脑胶质瘤、前列腺癌、宫颈癌和胰腺癌等。近来研究表明，在结直肠癌中FoxM1高表达的肿瘤细胞侵袭、转移能力增强[10]。USP22已被证实在多种肿瘤中高表达，并与细胞周期调控有关。FoxM1作为1个典型的细胞增殖因子，其在细胞周期调控中的作用在最近几年被确认[11]。但是，关于USP22与FoxM1在结直肠癌中表达相关性的研究，国内外报道尚不多见。

本研究结果发现，在结直肠癌组织中USP22、FoxM1的表达异常上调。此外，本研究发现53例（44.2%）结直肠癌组织中存在USP22/FoxM1共表达阳性；结直肠癌组织中USP22、FoxM1及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、LEF/TCF、c-myc的表达水平明显高于癌旁正常组织。这表明USP22、FoxM1可能参与了结直肠癌的发生、发展过程，且两者具有协同作用。然而，USP22、FoxM1在结直肠癌的发生、发展中的具体机制及两者的相互作用尚不清楚。FoxM1是一种核定位的转录因子，在向核内转移的过程中需要Wnt信号通路中的β-catenin伴随才能发挥作用，而USP22能去泛素化修饰β-catenin，使β-catenin不被降解。Zhang等[12]研究发现，FoxM1能与β-catenin结合并促进其核内移位进而上调Wnt/β-catenin信号通路的活性。因此，笔者推测USP22通过去泛素化胞浆内的β-catenin，促进FoxM1的核内转移；FoxM1可能参与USP22介导的细胞周期调控，最终影响结直肠癌细胞的增殖、侵袭、转移等过程。综上所述，USP22、FoxM1在结直肠癌组织中的表达均显著上调，且与患者的临床病理特征相关。两者可能起协同作用参与了结直肠癌的发生、发展过程。

[1] Ning Z,Wang A,Liang J,et al.USP22 promotes the G1/S phase transition by upregulating FOXM1 expression via β-catenin n-uclear localization and is associated with poor prognosis in stage II pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Int J Oncol,2014, 45(4)：1594-1608.

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[5] Liu Y L,Yang Y M,Xu H,et al.Increased expression of ubiquitin-specific protease 22 can promote cancer progression and predict therapy failure in human colorectalcancer[J].J GastroenterolHepatol,2010,25(11)：1800-1805.

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[8] Atanassov B S,Dent S Y.USP22 regulates cell proliferation by deubiquitinating the transcriptionalregulator FBP1[J].EMBO Rep, 2011,12(9)：924-930.

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[10] Li D,Wei P,Peng Z,et al.The critical role of dysregulated FOXM1-PLAUR signaling in human colon cancer progression and metastasis[J].Clin Cancer Res,2013,19(1)：62-72.

[11] Quan M,Wang P,Cui J,et al.The roles of FOXM1 in pancreatic stem cells and carcinogenesis[J].MolCancer,2013,12(50)：159.

[12] Zhang N,Wei P,Gong A,et al.FoxM1 promotes beta-catenin nuclear localization and controls Wnt target-gene expression and glioma tumorigenesis[J].Cancer Cell,2011,20(4)：427-442.

Expression of USP22 and FoxM1 in colorectal cancer and its clinicopathological significance

ZHANG Lin,GUO Zhiqin,YUAN Linna,et al.Department of Pathology,Jiaxing First Hospital,Jiaxing 314000，China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Ubiquitin-specific protease 22(USP22)and forkhead box M1 (FoxM1)proteins in colorectal cancer and its clinicopathological significance. Methods The expression of USP22 and FoxM1 was detected by immunohistochemical EnVision method and Western blot in 120 specimens of colorectal cancer tissue and 32 specimens of normal colorectal mucosa tissue. Results The positive expression rate of USP22 and FoxM1 in colorectal cancer tissues were significantly higher than that in adjacent normal tissues(both P＜0.05).The expression levels of USP22 and FoxM1 and Wnt/β-catenin proteins in colorectal carcinoma were significantly higher than those in adjacent normal tissue(all P＜0.05). USP22 and FoxM1 expressions were significantly correlated with histological grade,lymph node metastasis,liver metastasis and Duke's stage(all P＜0.05).The co-expression of USP22/FoxM1 was significantly correlated with lymph node metastasis,liver metastasis and Duke's stage in colorectal cancer patients (all P＜0.05). Conclusion Results indicate that USP22 and FoxM1 proteins may be involved in the occurrence and the development process of colorectal cancer.

ColorectalcancerUSP22 FoxM1 Clinicopathologicalfeatures

2016-05-03）

（本文编辑：李媚）

嘉兴市第一医院“启明星”计划（2014-YA-02）；嘉兴市科技计划项目（2013AY21042-3）；浙江省自然科学基金项目（LY15H160067）

314000 嘉兴市第一医院病理科

邬万新，E-mail：wanxinwu@outlook.com