茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的影响

严正强 杨远清 卢启海

茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的影响

严正强 杨远清 卢启海

目的 探讨茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞中调控细胞凋亡的生存素（Survivin）mRNA和蛋白表达的影响。方法在人前列腺癌PC-3M细胞培养器皿中分别加入用完全培养液稀释的0、40、60、80μg/ml茶多酚溶液，24、48h后应用RT-PCR和Western blot检测并比较Survivin mRNA、蛋白表达水平。结果 与0μg/ml组相比，40μg/ml组加入茶多酚48h后Survivin mRNA、蛋白表达水平均明显下调（均P＜0.05）；60、80μg/ml组加入茶多酚24、48h后Survivin mRNA、蛋白表达水平均明显下调（均P＜0.05），其中80μg/ml组下调最为明显（均P＜0.05）；大致呈剂量、时间依赖性（均P＜0.05）。结论 茶多酚可下调Survivin mRNA和蛋白表达水平，促进人前列腺癌PC-3M细胞调亡，在一定范围内呈剂量、时间依赖性。

茶多酚 前列腺癌 PC-3M细胞 细胞凋亡 生存素

茶叶是世界上三大饮品之一，经常饮用茶对人体健康有利。国内外学者证实茶多酚具有抗肿瘤、抗基因突变、抗菌消炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化、降压、降糖等多种生物学功能[1-5]。前列腺癌是老年男性高发的恶性肿瘤，是欧美等发达国家男性仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤[6]，但在中国、日本等长期饮茶的亚洲国家，前列腺癌发病率远低于欧美等发达国家[7-9]。因此，笔者就茶多酚对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞中调控细胞凋亡的生存素（Survivin）mRNA和蛋白表达的影响作一探讨，以期为前列腺癌的治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 茶多酚（98%）购自广州市齐云生物技术有限公司，胎牛血清购自依科赛（上海）生物制品有限公司，改良达尔伯克培养基（IMDM）购自美国GIBCO公司，Survivin抗体、β-Actin抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司，Survivin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。RT-PCR使用美国GeneAmp公司的PCR扩增仪9700型，蛋白电泳使用美国Bio-rad公司的蛋白质电泳装置、电转移系统，数据拍照记录使用上海Tanon凝胶成像系统2500R。

1.2 细胞株及培养条件 人前列腺癌PC-3M细胞株由吉林大学前列腺防治研究中心馈赠，培养在含10%胎牛血清的IMDM培养液中，置37℃、5%CO2湿化的培养箱中；待细胞融合70%～80%培养孔（瓶）时，将培养液更换为用完全培养液稀释的茶多酚溶液，其终浓度分别为0、40、60、80μg/ml，24、48h后检测Survivin mRNA和蛋白表达水平。

1.3 检测方法

1.3.1 RT-PCR检测人前列腺癌PC-3M细胞中Survivin mRNA表达水平 加药处理24、48h后提取细胞总RNA，应用半定量RT-PCR方法扩增目的基因Survivin和内参基因GAPDH，引物序列见表1。使用GIS凝胶分析软件进行光密度扫描分析，用Survivin产物与内参GAPDH产物的电泳亮度比值表示Survivin mRNA表达水平。

表1 Survivin与GAPDH的引物序列

1.3.2 Western blot检测人前列腺癌PC-3M细胞中Survivin蛋白表达水平 加药处理24、48h后收集、提取细胞总蛋白，应用Bio-rad法进行定量，取30μg蛋白进行12%聚丙烯酰氨凝胶电泳，电泳结束后转移蛋白至聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉、4℃封闭过夜，含0.05%Tween20的TBS缓冲液（TBST）洗膜3次，室温加入1∶400兔抗人Survivin抗体，孵育2h，TBST洗膜3次，加入1∶2 000稀释的羊抗兔IgG/AP，室温孵育2h，TBST洗膜3次，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝溶液显色。运用GIS凝胶分析软件进行光密度扫描分析，用Survivin蛋白与内参β-actin蛋白的电泳条带亮度比值表示Survivin蛋白表达水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。上述实验步骤重复3次，所得数据用表示，多组间比较采用多因素方差分析。

2 结果

2.1 各组Survivin mRNA表达水平的比较 与0μg/ml组相比，40μg/ml组加入茶多酚48h后Survivin mRNA表达水平明显下调（P＜0.05）；60、80μg/ml组加入茶多酚24、48h后Survivin mRNA表达水平均明显下调（均P＜0.05），其中80μg/ml组下调最为明显（均P＜0.05），见图1和表2。茶多酚可从mRNA表达水平下调Survivin基因转录，大致呈剂量、时间依赖性（均P＜0.05），见图2。

图1 各组SurvivinmRNA表达的电泳图

表2 各组SurvivinmRNA表达水平比较

图2 各组SurvivinmRNA表达水平与茶多酚剂量、时间的效应图（a：剂量效应；b：时间效应）

2.2 各组Survivin蛋白表达水平比较 与0μg/ml组相比，40μg/ml组加入茶多酚48h后Survivin蛋白表达水平明显下调（P＜0.05）；60、80μg/ml组加入茶多酚24、48h后Survivin蛋白表达水平均明显下调（均P＜0.05），其中80μg/ml组下调最为明显（均P＜0.05），见图3和表3。茶多酚可从蛋白表达水平下调Survivin基因转录，大致呈剂量、时间依赖性（均P＜0.05），见图4。

图3 各组Survivin蛋白表达的电泳图

表3 各组Survivin蛋白表达水平比较

图4 各组Survivin蛋白表达水平与茶多酚剂量、时间的效应图（a：剂量效应；b：时间效应）

3 讨论

肿瘤的发生、发展与细胞凋亡密切相关。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程。诱导肿瘤细胞凋亡是当前今治疗癌症的主要方法[10]。细胞凋亡是一个复杂的信号传导、蛋白酶级联反应过程，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）、凋亡抑制蛋白（IAPs）是调控凋亡反应的重要因子，其中Caspase-3是凋亡级联反应的必经之路，Tamm等[11]、郑雪梅等[12]通过体外实验证实Survivin可抑制Caspase-3的活性。

Survivin是目前发现最小的IAPs家族成员，由142个氨基酸构成，分子量16.5kDa，表达于细胞周期的G2/ M期，定位于细胞有丝分裂的纺锤体。1997年耶鲁大学Ambrosini等[13]通过效应细胞蛋白酶受体-1（EPR-1）的cDNA在人类基因组文库中筛选克隆发现，它与EPR-1均位于染色体（17q25）的75-130Kb的基因簇上，由3个内含子和4个外显子构成，两者区别在于EPR-1 mRNA长度为 1.3Kb，Survivin mRNA长度为 1.9Kb。Survivin与其他IAPs家族成员不同之处在于只含有1 个BIR序列，羧基端无环指结构而是1个由40个氨基酸组成的两性α-螺旋结构代之。目前研究认为Survivin抗凋亡作用的机制如下：（1）通过BIR分子中的氨基酸残基Trp67、Pro33和Cys84与Caspase-3、Caspase-7结合，从而抑制其活性；（2）通过α-螺旋结构与细胞有丝分裂微管结合，使Survivin与有丝分裂酶CDK1-cyclin B形成复合体，引起Survivin磷酸化，形成Survivin-Caspase-9复合物，从而抑制Caspase-9的活性；（3）Survivin与CDK4结合，引起CDK2-cyclin E的激活和pRB磷酸化，释放p21，最终导致CDK4与Procaspase相互作用而抑制细胞凋亡。Survivin的表达具有区域、时相选择性，在胚胎组织、肿瘤中高表达，在正常组织中不表达或仅少量表达，在癌旁组织中不表达。Tamm等[11]对美国国立癌症研究院抗癌药物筛选计划所选用的60种人肿瘤细胞株检测发现均有Survivin表达，且在乳腺癌、肺癌中表达最高，在肾癌中表达最低；国内学者郑雪梅等[12]研究结果亦持该观点。Rohayem等[14]报道在肺癌、结肠癌患者血清中Survivin抗体明显增高，提示Survivin可作为肺癌、结肠癌的标志物。Duffy等[15]实验表明膀胱癌患者尿液中可检测出Survivin抗体，因此Survivin亦可用于膀胱癌早期诊断及预后判断。由于Survivin在肿瘤组织中表达的特异性和本身结构的特殊性，即其唯一的BIR区若发生cys84→ala84A突变或THr34→Ala形成Survivin（T34A）则将丧失抑制凋亡的能力[8，10]，Survivin靶向阻断的抗肿瘤治疗具有无可替代的优势[16]：（1）Survivin靶向阻断可促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，而正常组织不受影响；（2）由于Survivin与EPR-1位于染色体（17q25）的同一基因簇，且两者编码序列广泛互补，故通过2个天然反义转录物的相互作用可以调节细胞凋亡；（3）由于Survivin基因突变体的存在，将其转染至细胞体内，亦可调节细胞凋亡。

之前有研究证实不同浓度的茶多酚作用于人前列腺癌PC-3M细胞后，细胞凋亡明显增强[17]；本研究亦证实茶多酚可从mRNA和蛋白表达水平下调Survivin基因转录，从而能促进人前列腺癌PC-3M细胞的凋亡，在一定范围内呈剂量、时间依赖性。

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Effect of tea polyphenols on mRNA and protein expression of survivin in prostate cancer PC-3M cells

YAN Zhengqiang,YANG Yunqing,LU Qihai.Department of Urology，Ningbo Medical Center Lihuili Eastern Hospital，Ningbo 315103,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of tea polyphenols on the mRNA and protein expression of survivin in prostate cancer PC-3M cells. Methods Human prostate cancer PC-3M cells were treated with 40,60,80μg/ml tea polyphenol for 24h or 48h,the mRNA and protein expression of survivin in PC-3M cells were detected by RT-PCR and western blot, respectively. Results The mRNA and protein expression of survivin in PC-3M cells treated with 60μg/ml and 80μg/ml for 24h and 48h was significantly decreased in a dose-dependent and time-dependent manner(P＜0.05). Conclusion Tea polyphenols can promote apoptosis of human prostate cancer PC-3M cells,which is related to the down-regulation of survivin gene transcription and translation.

Tea polyphenolProstate cancerPC-3Mcells Apoptosis Survivin

2016-04-11）

（本文编辑：陈丹）

315103 宁波市医疗中心李惠利东部医院泌尿外科（严正强、杨远清）；广西科技大学附属柳州市人民医院泌尿外科（卢启海）

严正强，E-mail：mqyz@tom.com