NLRP3炎性体相关分子表达与老年2型糖尿病的关系

洪宝建 苏丽韫 梁丽娟 朱月霞 徐芳 陈建忠

NLRP3炎性体相关分子表达与老年2型糖尿病的关系

洪宝建 苏丽韫 梁丽娟 朱月霞 徐芳 陈建忠

目的 研究核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性体相关分子表达与老年2型糖尿病（T2DM）的关系。方法 采用ELISA法测定30例老年T2DM患者、30例健康体检者（对照组）血浆中IL-1β、IL-18和IL-37水平，分别采用定量聚合酶链反应（PCR）技术和ELISA技术检测糖尿病患者单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）表达NLPR3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和IL-1β mRNA水平及葡萄糖诱导MDM分泌IL-1β和TNF-α的水平。结果 老年T2DM患者血浆中的IL-1β和IL-18水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而IL-37无统计学差异；T2DM患者MDM中NLPR3、ASC和IL-1β mRNA表达水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；且经葡萄糖刺激后IL-1β、TNF-α水平显著高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。结论 NLRP3炎性体相关分子的表达与炎性体活化可能参与老年T2DM的炎症反应过程。

白细胞介素-1β 2型糖尿病 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 炎性体 肿瘤坏死因子

我国糖尿病患者已超过9 200万，此外尚有约1.48亿人处于糖尿病前期，有发展为糖尿病的趋势。2型糖尿病（T2DM）是一种多基因遗传性、进展性疾病，尽管其发病机制尚未完全明了，但是越来越多的实验结果和临床研究证明炎症与免疫是T2DM发生、发展的驱动力[1-3]。近年来有学者提出核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）介导的炎性体激活途径在T2DM发生、发展过程中起着重要的作用[4-10]，笔者通过观察老年T2DM患者NLRP3炎性体相关分子的表达以及葡萄糖刺激剂对巨噬细胞炎性体活化途径的作用，探讨NLRP3炎性体活化途径在T2DM发病中的作用，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2014年1月至2015年6月在浙江省人民医院门诊及住院的老年T2DM患者共30例，男13例，女17例，年龄62～89（76.3±14.5）岁。所有患者均符合1999年WHO糖尿病诊断标准，初诊，未经任何降糖药物等治疗。排除严重心、肝、肾疾病、糖尿病慢性并发症、急性和慢性感染、近期手术和创伤、恶性肿瘤、自身免疫病以及其他内分泌系统疾病。选取浙江省人民医院同期健康体检者30例作为对照组，男16例，女14例，年龄56～85（74.6±13.4）岁；排除T2DM、动脉粥样硬化、痛风病等疾病。两组性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 T2DM患者入院后清晨空腹抽取静脉血5ml，健康对照组于健康体检时抽取，肝素抗凝，充分混匀后，以1 200r/min离心10min，将血浆和红细胞迅速分离，将血浆置于EP管，置于4℃冰箱保存，用于检测IL-1β、IL-18和IL-37含量。

1.2.2 外周血单个核细胞分离 采用密度梯度离心法分离T2DM患者和健康对照组的单个核细胞，分化为巨噬细胞（MDM），提取总RNA，采用定量PCR检测MDM NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、IL-1β mRNA表达。用葡萄糖刺激患者和对照组的MDM，采用ELISA技术检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β水平。

1.2.3 定量PCR检测 参考文献[7]设计和合成引物，详见表1。

表1 引物序列

1.2.4 RNA的提取、反转录及荧光定量PCR 根据Trizol试剂盒说明书提取总RNA，加入20μl的DEPC水溶解，测定RNA浓度和光密度比值（OD），符合要求后按照试剂盒说明书进行逆转录反应，10μl反应体系中包括 PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1μl，5xPrimeScriptTMBuffer 2μl，RNA 2μl，引物1μl，DEPC水4μl，反应物4℃储存待用。根据参考文献[7]在ABI 7500定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR检测，20μl反应体系中含SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）10μl，PCR上游和下游引物各1μl，逆转录反应液（cDNA溶液）2μl，DEPC水6μl，反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；每个样品设定3个复孔，并使用熔解曲线分析引物特异性。用2-△△Ct法计算出每组样本的基因表达量，每种检测重复3次。

1.2.5 细胞因子检测 采用双抗体夹心法ELISA试剂盒（美国eBioscience公司）检测外周血IL-1β、IL-18和细胞培养上清液TNF-α、IL-1β水平，按试剂盒说明操作，酶标仪（美国BIO-RAD公司）测定450nm处吸光度（A）值，以试剂盒提供的标准品测定结果绘制标准曲线，计算细胞因子的含量。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件。计量资料以表示，组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 两组血浆中细胞因子水平的比较 T2DM组患者IL-1和IL-18水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；IL-37水平略高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

表2 两组血浆中细胞因子水平的比较

2.2 两组MDM NLRP3炎性体相关分子表达水平的比较 T2DM组患者NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表达显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表3。T2DM患者分离的MDM经葡萄糖刺激后细胞培养上清液中的TNF-α、IL-1β水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表4。

表4 两组MDM经葡萄糖刺激产生细胞因子水平的比较

3 讨论

T2DM发病机制目前尚不清楚，近年来随着固有免疫研究的迅速进展，有关固有免疫细胞炎性体途径介导的炎症反应在自身免疫炎症性疾病中的作用越来越受到关注。炎性体是由模式识别受体如NLR识别配体后与接头蛋白ASC、半胱天冬酶-1等形成的大分子的复合物[11]，形成后能激活半胱天冬酶-1，活化的半胱天冬酶-1继而通过酶切IL-1β和IL-18前体分子而生成具有生物学活性的IL-1β和IL-18，进而调节炎症反应。NLRP3炎性体是研究较多的一种，由NLRP3、ASC和半胱天冬酶-1组成[5]。多种内源性刺激物[12]如葡萄糖、游离脂肪酸、尿酸钠（MSU）结晶及胞质外ATP和外源性刺激物如细菌、病毒等成分能诱导NLPR3的活化，通过诱导促炎性细胞因子如IL-1β的产生，在如糖尿病[4，6-7]、动脉粥样硬化[13-14]等免疫炎症性疾病[15]中的作用日益受到重视。

近来研究发现固有免疫细胞如巨噬细胞、内皮细胞、枯否细胞吞噬游离脂肪酸（FFA）、葡萄糖后，可激活炎性体途径，释放炎症因子如IL-1β、TNF-α等，在T2DM的发生、发展中起重要的作用[4，6-7]。本研究显示，老年T2DM患者血浆中的IL-1β和IL-18水平显著高于健康对照组，与文献报道[7-8]相似，提示老年T2DM患者的可能存在慢性低度炎症状态。IL-37是新近发现的具有抗炎症作用的细胞因子[16]，本研究结果显示，老年T2DM患者血浆中IL-37水平略高于对照组，但无统计学差异，提示IL-37在T2DM炎症的调节中可能起一定的作用。为进一步研究T2DM患者固有免疫细胞NLRP3炎性体相关分子的表达以及对葡萄糖刺激的敏感性，将外周血单个核细胞分离后进一步分化为MDM，采用实时荧光PCR检测MDM中NLRP3、ASC、IL-1β mRNA表达，发现老年T2DM患者来源MDM的NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表达显著高于对照组，提示患者的炎性体易被激活。用一定浓度的葡萄糖刺激后发现T2DM患者MDM的TNF-α、IL-1β水平均显著高于对照组，与文献报道糖尿病患者NLRP3炎性体相关分子表达及葡萄糖能诱导NLRP3炎性体激活相一致[7]。以上结果提示由葡萄糖刺激引起的炎性体激活途径可能在老年人T2DM的发生、发展中起重要的作用。

本研究发现老年T2DM患者血浆IL-1β和IL-18水平显著高于对照组，并发现患者来源的MDM NLRP3炎性体相关分子的基因表达水平高于对照组，经葡萄糖刺激后IL-1β和TNF-α的水平显著高于健康对照组，结果提示NLRP3炎性体活化途径在老年人T2DM的发生、发展中起着一定的作用。近来研究发现炎性体活化途径抑制剂在炎性体相关疾病的治疗中取得较好的效果[18]，为进一步研制开发有效的T2DM药物提供了一定的策略。

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Expression of NLRP3 inflammasome-related molecules in elderly patients with type 2 diabetes mellitus

HONG Baojian,SU Liyun, LIANG Lijuan,et al.Department of Central Laboratory Medicine,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014，China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of NLRP3 inflammasome-related molecules in elderly patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM). Methods The plasma levels of IL-1β,IL-18 and IL-37 in 30 T2DM patients and 30 healthy controls were measured with ELISA;the expression of NLRP3,ASC and IL-1β in monocytes derived macrophages(MDM)were detected by real time PCR.The contents of IL-1β and TNF-α secreted by MDM treated by glucose were also analyzed. Results Plasma IL-1β and IL-18 levels in T2DM patients was significantly higher than those in healthy controls(P＜0.05),while IL-37 level was no significantly increased(P＞0.05).Expression of NLRP3,ASC and IL-1 in MDM and IL-1β,TNF-α secreted by MDM were significantly higher than those in controls(P＜0.05). Conclusion The NLRP3 inflammasome pathway may be involved in the inflammatory process of elderly patients with T2DM.

IL-1β T2DM NLRP3 InflammasomesTNF

2016-05-03）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省医药卫生科技计划项目（2016KYB032）

310014 杭州，浙江省人民医院检验中心（洪宝建、苏丽韫、梁丽娟、朱月霞、徐芳）；浙江大学医学院免疫学研究所（陈建忠）

陈建忠，E-mail：chenjianzhong@zju.edu.cn