微囊蛋白1及细胞内钙离子在TGF-β1诱导哮喘大鼠气道平滑肌增殖中的作用

王瑞丽 戴威 李凤琴 吴立琴 戴元荣

微囊蛋白1及细胞内钙离子在TGF-β1诱导哮喘大鼠气道平滑肌增殖中的作用

王瑞丽 戴威 李凤琴 吴立琴 戴元荣

目的 探讨微囊蛋白1、细胞内钙离子在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖中的作用。方法 离体培养大鼠ASMCs，并分为正常组、哮喘组、TGF-β1干预组、TGF-β1+β-环糊精（β-CD）干预组，CCK-8法检测各组细胞的增殖水平；Western blot法检测各组微囊蛋白1含量；流式细胞仪检测各组ASMCs胞内钙离子荧光强度。结果 哮喘组OD值较正常组明显增加（P＜0.05），TGF-β1组OD值较正常组、哮喘组明显增加（P＜0.05），TGF-β1+β-CD组OD值较TGF-β1组明显增加（P＜0.05）。TGF-β1组较正常组和哮喘组微囊蛋白1含量减少（P＜0.05），TGF-β1+β-CD组较TGF-β1组微囊蛋白1含量减少（P＜0.05）。TGF-β1组较正常组和哮喘组胞内钙离子荧光强度增加（P＜0.05），TGF-β1+β-CD组较TGF-β1组胞内钙离子荧光强度增加（P＜0.05）。相关关系分析示细胞增殖水平与微囊蛋白1含量呈负相关（r=-0.51，P＜0.05），细胞增殖水平与钙离子荧光强度呈正相关（r=0.60，P＜0.05），微囊蛋白1含量与钙离子荧光强度呈负相关（r=-0.87，P＜0.05）。结论 微囊蛋白1可以抑制TGF-β1诱导的ASMCs增殖,这种抑制作用可能部分是通过减少胞内游离钙离子来实现的。

哮喘 平滑肌细胞 增殖 微囊蛋白 转化生长因子β1 钙离子 β环糊精类 大鼠

气道重塑被认为是引起难治性哮喘的重要病理生 理基础，在哮喘发病中的作用越来越受到重视。而气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖在哮喘气道重塑中占有十分重要的地位[1]。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）能刺激ASMCs的分裂与增殖，微囊和微囊蛋白1是ASMCs对细胞外信号的核心处理器[2]。本课题组前期研究显示，微囊蛋白1能通过抑制ASMCs增殖来影响哮喘的气道重塑[3-4]，但微囊蛋白1对ASMCs增殖的抑制作用以及TGF-β1对其调控的具体机制尚不清楚；Zon等[5]发现在大鼠ASMCs中，钙池操纵的钙通道电流在细胞增殖期明显高于静止期，钙池操纵的钙通道阻滞剂Ni2+可以抑制ASMCs的增殖。另有研究发现，在人的ASMCs中，微囊蛋白1在调节胞外钙离子进入胞内过程中发挥重要作用[6]。笔者拟通过体外培养ASMCs，探讨微囊蛋白1及胞内钙离子在TGF-β1诱导ASMCs增殖中的作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 动物和试剂 SPF级雄性SD大鼠由本校实验动物中心提供,体重100～120g，合格证号：SYXK（浙）2010-0150）。TGF-β1（美国PeproTech公司），RPMI 1640培养基（美国HyClone公司），优级胎牛血清（杭州四季青公司），1型胶原酶（美国Sigma公司），胰酶细胞消化液、青霉素、链霉素（江苏碧云天生物工程有限公司），ECL试剂盒（美国Pierce公司），微囊蛋白1抗体、FITC标记的山羊抗兔二抗（美国Abcam公司），GAPDH抗体、FITC标记的山羊抗小鼠二抗（江苏碧云天生物工程有限公司），Fluo-3/AM（日本Dojindo公司），β环糊精（β cyclodextrin，β-CD）（美国CST公司）。

1.2 ASMCs培养及分组 参照Palmans等[7]方法成功建立大鼠慢性哮喘模型后，将正常和哮喘大鼠利用组织块贴壁法进行ASMCs培养。待细胞长满后用胰酶细胞消化液传代。用 3～6代细胞进行实验。实验所用的ASMCs用平滑肌α肌动蛋白（α-actin）抗体，SABC免疫组织化学法进行鉴定。ASMCs培养成功后分为正常组、哮喘组、10μg/L TGF-β1干预组、10μg/L TGF-β1+β-CD干预组。

1.3 CCK-8法检测ASMCs的增殖 取3～6代细胞，消化、离心后，用含l0%FBS的RPMI 1640培养基将细胞浓度调至4×103～5×103/ml，然后接种于96孔板，每孔100μl，待细胞80%～90%融合后，换无血清RPMI 1640培养24h，使细胞同步于G0期，正常组、哮喘组用含10%FBS的RPMI 1640培养基培养；TGF-β1干预组加入10μg/L TGF-β1继续培养，TGF-β1+β-CD干预组在加入TGF-β1前1h，先加入10mmol/L的β-CD。培养结束时，在每孔中加入10μl CCK-8，混匀后继续置于37℃，5%CO2孵箱中培养1～4h，注意避光操作。酶联免疫检测仪450 nm波长测定各孔OD值。每组设4个复孔，实验重复4次。CCK-8试剂检测细胞增殖时，细胞增殖越多越快，颜色便越深，所测OD值越大，故将OD值作为各组细胞增殖水平。

1.4 Western blot法检测ASMCs上微囊蛋白1的含量提取上述各组干预后的ASMCs总蛋白质，以BCA法进行蛋白定量。按每孔40μg蛋白量加样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的蛋白转膜至PVDF膜后，以5%脱脂奶粉室温封闭1～2h，分别加兔抗大鼠微囊蛋白1抗体（1∶1 000）及小鼠抗大鼠GAPDH抗体（1∶5 000）孵育，4℃过夜。TBST洗膜后加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（1∶2 000）及山羊抗小鼠二抗（1∶3 000），室温孵育1～2h，洗膜，ECL显影。采用AlphaEaseFC 4.0软件分析目的蛋白微囊蛋白1和内参GAPDH的吸光度值，以目的蛋白和内参吸光度的比值代表目的蛋白的相对含量。

1.5 流式细胞仪检测ASMCs细胞内游离钙离子 取上述各组干预后的ASMCs，用胰酶细胞消化液消化成单细胞悬液，1 000r/min离心5min，弃上清液，用PBS洗涤细胞2次，1 000r/min离心5min，使用无血清的培养基重悬细胞，加入5μl的Fluo-3/AM母液使其终浓度为5μmol/L，37℃避光孵育30min，用PBS洗涤细胞3次，1 000r/min离心5min，用PBS重悬细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，上流式细胞仪检测细胞内钙离子荧光强度。

1.6 统计学处理 应用SPSS 17.0及GraphPad Prism 5统计软件。正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差为齐性者采用LSD－t法，方差不齐者采用Dunnett’s T3检验；非正态分布的计量资料以中位数表示，多组间比较采用Kruska-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi法检验；相关关系分析采用Pearson相关。

2 结果

2.1 各组ASMCs增殖水平的比较 结果显示，正常组OD值为0.87±0.11，哮喘组为1.01±0.16，10 μg/L TGF-β1组为1.11±0.15，10 μg/L TGF-β1+β-CD组为1.25±0.13，哮喘组细胞OD值较正常组明显增加（P＜0.05）；TGF-β1组OD值较正常组、哮喘组明显增加（P＜0.05）；TGF-β1+ β-CD组OD值较TGF-β1组明显增加（P＜0.05）。

2.2 各组ASMCs上微囊蛋白1含量的比较 TGF-β1组较正常组和哮喘组微囊蛋白1含量减少（P＜0.05）；TGF-β1+β-CD组较TGF-β1组微囊蛋白1含量减少（P＜0.05），详见图1。

图1 各组ASMCs上微囊蛋白1含量的比较（与正常组比较，*P＜0.05；与哮喘组比较，△P＜0.05；与TGF-β1组比较，▲P＜0.05）

2.3 各组ASMCs细胞内游离钙离子荧光强度的比较TGF-β1组较正常组和哮喘组胞内钙离子荧光强度增加（P＜0.05）；TGF-β1+β-CD组较TGF-β1组胞内钙离子荧光强度增加（P＜0.05），见图2。

图2 各组ASMCs细胞内游离钙离子荧光强度的比较（与正常组比较，*P＜0.05；与哮喘组比较，△P＜0.05；与TGF-β1组比较，▲P＜0.05）

2.4 相关性分析 细胞增殖与微囊蛋白1蛋白含量呈负相关（r=-0.51，P＜0.05），细胞增殖与钙离子荧光强度呈正相关（r=0.60，P＜0.05），微囊蛋白1蛋白含量与钙离子荧光强度呈负相关（r=-0.87，P＜0.05）。

3 讨论

近年研究表明，TGF-β1是导致气道重塑的重要细胞因子[8]。本课题组前期研究发现在一定浓度和作用时间范围内，10μg/L为TGF-β1的最佳干预浓度[9]。故本实验选取10μg/L TGF-β1进行哮喘组细胞干预。结果显示，TGF-β1可以促进哮喘ASMCs的增殖。

微囊是存在于细胞膜上烧瓶样的内陷微结构，它参与细胞的众多生命活动。微囊蛋白1是微囊最重要的结构蛋白，与平滑肌细胞的增殖密切相关[2]。研究证实微囊上有TGF-β受体（transforming growth factor-βreceptor，TβR）的存在[10]。TGF-β1主要通过与微囊上的TβR结合发挥作用。另有研究发现，脂筏介导的TβR内在化和或）微囊蛋白1介导的TβR内吞作用可促进受体降解，进而抑制细胞信号传导[11-13]。本研究发现，在TGF-β1促进ASMCs增殖过程中，微囊蛋白1表达量明显下降，使用胆固醇剔除剂β-CD破坏微囊后，微囊蛋白1的表达进一步减少，ASMCs的增殖明显增加，相关关系分析显示细胞增殖与微囊蛋白1含量呈负相关。因此本研究表明微囊蛋白1在TGF-β1诱导ASMCs增殖过程中发挥着负性调控作用。

钙离子信号是维持ASMCs功能的重要机制，细胞内钙离子浓度增高可促进气道平滑肌增生肥厚[14]。Sathish等[15-16]发现，微囊蛋白1在调节人ASMCs细胞内钙离子浓度中发挥重要作用。本实验结果显示，TGF-β1刺激ASMCs后胞内钙离子荧光强度明显高于哮喘组和正常组，而使用β-CD干预后，其较单独TGF-β1刺激，细胞内钙离子荧光强度增加更为明显,且与细胞增殖呈正相关，提示微囊蛋白1表达的缺失，可引起ASMCs胞内游离钙离子的增加，促进细胞的增殖，但微囊蛋白1调节ASMCs胞内钙离子的机制尚待进一步的研究。

综上所述，微囊蛋白1可抑制TGF-β1引起的ASMCs增殖，在哮喘气道重塑中发挥重要作用，该过程可能部分是通过减少胞内游离钙离子实现的。

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Effect of caveolin-1 and intracellular Ca2+on the TGF-β1-induced ASMCs proliferation in asthmatic rats

WANG Ruili,DAI Wei, LI Fengqin,et al.Department of Critical Care,the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027, China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of caveolin-1 and intracellular Ca2+([Ca2+](i))on TGF-β1-induced proliferation of airway smooth muscle cells(ASMCs)in asthmatic rats. Methods ASMCs ofrats were isolated and cultured in vitro. CCK-8 method was used to detect cell proliferation and Western blot method was used to detect the expression of caveolin-1 protein.FCMwas used to detect[Ca2+](i). Results OD value in asthma group was higher than that in normal group (P＜0.05), OD value in TGF-β1 group was higher than that in normal group and asthma group(P＜0.05),OD value in TGFβ1+β-CD group was higher than that in TGF-β1 group(P＜0.05).The expression of caveolin-1 in TGF-β1 group was significantly lower than that in normal group and asthma group(P＜0.05),the expression of caveolin-1 in TGF-β1+β-CD group was significantly lower than that in TGF-β1 group(P＜0.05).The[Ca2+](i)of ASMCs in TGF-β1 group was higher than that in normal group and asthma group(P＜0.05),the[Ca2+](i)of ASMCs in TGF-β1+β-CD group was higher than that in TGF-β1 group(P＜0.05).There was negative correlation between cell proliferation and the expression of caveolin-1 protein(r=-0.51,P＜0.05),cell proliferation was positively correlated with the[Ca2+](i)(r=0.60,P＜0.05),caveolin-1 protein was negatively correlated with the[Ca2+](i)(r=-0. 87,P＜0.05). Conclusion Caveolin-1 cab suppress TGF-β1-induced ASMCs proliferation in asthmatic rats,which is associated with the decrease of[Ca2+](i).

Asthma Airway smooth muscle cells Proliferation Caveolins TGF-β1 Ca2+Beta-cyclodextrins Rats

2016-03-21）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省医药卫生科技计划（2009A144）

325027 温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院重症医学科（王瑞丽、戴威），呼吸内科（李凤琴、吴立琴、戴元荣）

戴元荣，E-mail：daiyr@126.com