小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型建立及其MicroPET检测研究

王兆洪 陈晶晶 黄崇杰 童洪飞 金洲祥 周斌 王继生 陈辉

小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型建立及其MicroPET检测研究

王兆洪 陈晶晶 黄崇杰 童洪飞 金洲祥 周斌 王继生 陈辉

目的 探索理想的小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型建立方法和移植瘤生长检测方法。方法 将小鼠人胰腺癌皮下移植瘤制成瘤体，原位包埋于健康的BALB/c雌性小鼠胰腺尾部被膜下，20只小鼠均接种成功，建模4周后应用MicroPET检测小鼠体内移植瘤的生长情况。结果 MicroPET检测显示所有小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型均建立成功，成功率为100%；检测到肿瘤对18FDG的平均标准摄取值为（4.30±0.35）。结论 瘤体原位包埋法是建立小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型较理想的方法，操作简便，成功率高；MicroPET是检测移植瘤生长情况的可靠辅助检查方法，可以用于胰腺癌动物模型的监测。

胰腺肿瘤 原位移植瘤 裸鼠模型 MicroPET

胰腺癌是一种预后很差的消化系统恶性肿瘤，起病隐匿，病情发展迅速，治疗效果较差，85%的患者在确诊后12个月内病死。超声、CT、内镜下逆行胰胆管造影术等传统的影像学技术对胰腺癌诊断均有重要作用，但都存在局限性，难以发现小的病灶及完全区分炎症性、良性及恶性病灶。正电子发射型计算机断层显像（PET）利用功能成像可准确鉴别良、恶性肿瘤，18-氟脱氧葡萄糖（18FDG）能聚积在肿瘤细胞中并经PET检测到[1]，因此应用PET检测细胞对18FDG的摄取可反映肿瘤细胞的代谢及增殖情况，更容易发现小的病灶，把握早期手术时机，提高手术切除率[2]。MicroPET是用于检测动物模型的一种18FDG-PET。

小鼠人胰腺癌移植瘤模型是研究胰腺癌生物学特性的重要基础，目前有皮下移植瘤、原位移植瘤和胰腺癌肝脏转移瘤等众多模型供科研应用。传统较常用的建模方法是将肿瘤细胞注射到小鼠的皮下形成皮下移植瘤，或者注射到相应器官生成相应器官的原位移植瘤模型。但细胞注射法培养细胞量大且细胞易发生污染，在注射过程中容易渗漏，人为地导致肿瘤细胞在腹腔内转移，会对肿瘤的侵袭性研究造成严重的干扰；再加上皮下移植瘤生长时易被纤维包绕，肿瘤血管生成受干扰，不能很好地模拟人胰腺癌。基于此，本实验运用瘤体原位包埋法建立小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型，后用MicroPET检测模型的成功率并监测移植瘤的生长情况，以期为临床研究胰腺癌的早期诊断提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司；18FDG由浙江大学医学院附属第二医院提供；人胰腺癌细胞Panc-1购于美国模式培养物存库。

1.2 实验动物 4～6周龄健康BALB/c雌性小鼠购于中国科学院上海实验动物中心，体重18～20 g，饲养于SPF屏障系统的洁净层流架内(无特定病原体级)，室温控制在(25±1)℃，相对湿度40%～60%。

1.3 细胞培养 人胰腺癌细胞Panc-1培养于含10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和 100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃含5%二氧化碳的细胞培养箱中培养，每3d换液1次。细胞单层贴壁生长，约80%融合时胰蛋白酶消化传代。

1.4 原位移植瘤模型的制备

1.4.1 小鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型的建立 采用细胞注射法建立小鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，具体方法如下。（1）待肿瘤细胞生长至对数期，弃去培养液，用灭菌的PBS液洗涤2次，加入1ml含0.25%胰蛋白和0.02%EDTA的消化液，轻摇培养瓶，使消化液均匀覆盖在细胞表面；（2）放置于37℃培养箱中消化3min，倒置显微镜下见胰腺癌细胞的细胞质回缩、细胞间隙增大时，加入培养基终止消化，用灭菌滴管轻轻吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液；（3）待细胞完全脱落培养瓶壁时，迅速转移至含培养基的无菌离心管中，1 000r/min离心5min后弃上清液，加入RPMI-1640培养液，调整细胞密度为约107个/ml；（4）用1ml的无菌注射器吸取约0.2 ml RPMI-1640培养基（含有约5×106个处于对数生长期的Panc-1胰腺癌细胞的细胞悬液）；（5）用手固定小鼠，助手用75%乙醇棉球消毒小鼠近左侧后肢皮肤，后将细胞悬液注射到小鼠皮下形成皮丘（图1，见插页），保证穿刺点无液体渗出。用上述方法建立小鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型2只。

1.4.2 小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型的建立 采用瘤体原位包埋法建立小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型，具体方法如下：（1）皮下移植瘤接种4周后（图1b，见插页），待移植瘤体积长至100～150 mm3，脱臼法处死小鼠，取出肿瘤组织并去除坏死部分，制作成大小约3×3×3mm3的瘤块放置于盛有含10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PMI 1640培养液的培养皿中备用（图2a，见插页）；（2）75%乙醇消毒4～6周龄健康BALB/c雌性小鼠腹部皮肤，用2%戊巴比妥钠（剂量为50mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，麻醉起效后将小鼠仰卧位固定在鼠板上；（3）取左上腹直肌旁1cm切口，暴露脾脏和胰腺尾部，在放大镜下剪开胰腺被膜，将瘤块植入胰体尾处，以8-0缝线缝合胰腺被膜（图2b，见插页），将胰腺轻轻送回腹腔后分两层关闭腹壁（图2c，见插页）。用上述方法建立小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型20只。

1.5 MicroPET监测小鼠人胰腺癌原位移植瘤的生长建模成功4周后[3]行MicroPET检测；模型显像前夜所有模型小鼠均被禁食，但可自由饮水；具体方法如下：（1）将约0.1ml/只（约37MBq）18FDG经尾静脉注入模型小鼠；（2）在注射后40min应用德国西门子公司R4 microPET（借用自浙江大学医学院附属第二医院，图3a）扫描采集，将小鼠用0.2%的异氟烷麻醉后，用医用胶带沿扫描仪长轴俯卧位固定（图3b），在重建图形的矢状位上勾画出显像肿瘤所占面积的感兴趣区（ROI），利用microPET ASI Pro6.0.5.0软件分别记录并计算肿瘤组织对18FDG的平均标准摄取值（SUV）[4]。SUV值越大，18FDG在此处聚积越多，说明组织代谢越活跃，肿瘤组织恶性程度越高，SUV=单位体积病变组织示踪剂活度（Bq/ml）/[显像剂注射剂量（Bq）/体重（g）]。（4）检查后脱臼法处死小鼠，取出瘤体称重，取部分瘤体、心、肝、胰腺及双肾部分组织用多聚甲醛固定，以供病理组织切片和免疫组织化学染色检测使用，部分组织存放于液氮中备用。

图3 MicroPET扫描小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型（a：18-FDG生成装置；b：将小鼠用0.2%的异氟烷麻醉后，用医用胶带沿扫描仪长轴俯卧位固定，应用microPET扫描检查）

1.6 肿瘤组织病理学检查 处死小鼠后取肿瘤组织，行HE染色病理学检查，观察镜下（×400）染色情况。

1.7 肿瘤组织免疫组织化学检查 肿瘤组织经石蜡切片，常规脱蜡水化，按照二步法Ki-67试剂盒所示的操作步骤进行染色、脱水、透明、封片、镜检，观察镜下（×400）染色情况。选择10个高倍视野进行细胞计数，根据染色程度和着色细胞百分率进行半定量结果判定。细胞质基本不着色记0分，细胞质染淡黄色记1分，染棕黄色记2分，染棕褐色记3分；着色细胞占计数细胞百分率≤5%记0分，5%～25%记1分，26%～50%记2分，＞50%记3分；上述两项得分乘积作为最后判定结果：0～1分为阴性，2～3分为弱阳性，4～6分为阳性，＞6分为强阳性。

2 结果

2.1 人胰腺癌原位移植瘤模型小鼠的一般情况 20只人胰腺癌原位移植瘤模型小鼠建模后第2天饮水、进食均正常，2周后开始出现纳差、活动力减弱，28d后均出现消瘦、恶液质等表现。模型小鼠在建模后7、14、21、28d的平均体重分别为21.4、23.6、19.7、17.6g。

2.2 小鼠人胰腺癌原位移植瘤的生长情况 建模4周后，MicroPET检测到小鼠腹腔内胰腺癌较周围组织呈现明显高代谢状态，肿瘤病灶较正常组织容易分辨；20只小鼠均能检测出有肿瘤生长（图4，见插页），成瘤率100%；检测到肿瘤组织对18FDG的平均SUV为（4.30± 0.35），但未检测出肿瘤转移情况。

2.3 小鼠人胰腺癌原位移植瘤的病理学及免疫组织化学表现 腹腔探查小鼠可见胰腺癌生长，暴露并取出原位移植瘤（图5a，箭头处，见插页），可见肿瘤组织与周围肠管、肝脏等有轻度粘连，与MicroPET检测显像不完全一致。病理学检查显示肿瘤组织中血管较丰富,肿瘤细胞增殖活跃，细胞核极不规则且缺乏极性，核仁多呈分叶状（图5b，见插页）。免疫组织化学检查显示肿瘤组织Ki-67呈强阳性表达。

3 讨论

胰腺位置深，胰腺癌起病隐匿，早期患者并无明显症状，就诊时多数己为晚期胰腺癌。早期诊断和治疗对胰腺癌预后尤为重要，先进的诊断手段及创新的治疗方案是胰腺癌临床诊疗迫切需要的。

Manzotti等[5]应用人胰腺癌组织建立小鼠人胰腺癌移植瘤模型，这种模型的特点是保持了肿瘤的转移性和侵袭性。有文献报道，小鼠原位移植瘤模型的肿瘤组织可以从一个小鼠模型转移到另一个模型，仍然能保持肿瘤生长和侵袭的特性[6]。本实验中，笔者建立胰腺癌原位移植瘤模型需要有胰腺癌瘤体，初次细胞用量较大，获得瘤体的过程比较费时，但再次接种时可以利用原位移植瘤的瘤块接种，同样可以获得原位移植瘤。这样既可节省建模时间，又保持了肿瘤的转移性和侵袭性。

因肿瘤位于腹腔，原位移植瘤建模后不像皮下移植瘤能够容易地观察并记录其生长的情况，未处死小鼠前不能用简单的方法计算成瘤率，不易观察治疗过程中肿瘤对药物的反应。目前检测胰腺癌原位移植瘤的常用方法有活体荧光成像、小鼠腹腔镜等[7]。许多恶性肿瘤包括胰腺癌的己糖激酶和其他的葡萄糖代谢酶过表达[8]，恶性肿瘤在葡萄糖代谢方面的改变为18FDG功能性成像提供了基础。18FDG-PET可以通过检测到糖酵解增加区分恶性与良性组织。

PET是目前已在临床推广应用的一种核医学检查，18FDG-PET显像己被应用于肺癌等[9]的诊断，并被认为是目前肿瘤显像的最佳方法之一[10]。18FDG-PET不但在诊断肺癌、肝癌、胃癌等方面具有重要的参考价值，而且在胰腺癌的诊断、分期、分级及其手术后复发的诊断，指导治疗均有重要临床意义。本实验采用瘤体原位包埋法建立小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型，然后利用MicroPET检测模型的成瘤率及生长情况。结果发现，成功率100%；建模成功的小鼠腹腔肿瘤组织较周围组织呈现明显高代谢状态，肿瘤病灶容易分辨。

SUV代表组织的糖酵解是否活跃即组织的代谢生长，SUV越大，组织的代谢越旺盛[11]。本实验中MicroPET成像后，笔者利用MicroPET ASIPro6.0.5.0软件计算肿瘤组织的SUV，结果显示病灶处呈明显的高代谢状态；处死小鼠后探查腹腔，肿瘤组织病理学检查符合胰腺癌的诊断；免疫组织化学法检测肿瘤组织中Ki-67的表达呈强阳性。

综上所述，在熟练的技术条件下瘤体原位包埋法建立的小鼠人胰腺癌原位移植瘤模型成瘤率高，建立的模型有良好的增殖和侵袭特性。临床对胰腺癌实现真正意义上的早期诊断，必须从细胞和分子水平上发现并诊断胰腺癌，因此分子影像学技术是解决胰腺癌早期诊断问题的根本方法。MicroPET可用于检测小鼠胰腺癌原位移植瘤模型的成瘤率及生长情况。

4 志谢

感谢浙江大学医学院附属第二医院PET中心全体工作人员对本实验的帮助和技术指导。

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Establishment of orthotopic transplatation model of human pancreatic cancer in nude mice

WANG Zhaohong,CHEN Jingjing,HUANG Chongjie,et al.Department of Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

【 Abstract】 Objective To establish an orthotropic transplatiation mofel of human pancreatic carcinoma in nude mouse. Methods The small piece of human pancreatic carcinoma from xenograft was implanted subcapsularly in the tail of pancreas in 20 female BALB/c nude mice.The growth of transplanted tumors were observed with microPET imaging 4 weeks after operation,then the animals were sacrificed by cervical dislocation and the samples of tumor were obtained. Results Four weeks after implantation,the orthotopic transplatation nude mice model was established with a success rate of 100.0%. MicroPET showed that the mean uptake value of 18FDG in tumor mass was(4.30±0.35). Conclusion The orthotopic human pancreatic cancer nude mouse model has been successfully established,and MicroPET can be used to examine the growth of transplanted pancreatic carcinoma in nude mice.

Pancreatic carcinoma Orthotopic transplantation tumor Nude mouse modelMicroPET

2016-02-24）

（本文编辑：李媚）

浙江省中医药科技计划项目（2014ZQ020）；温州市公益性科技计划项目（Y20140694）

325027 温州医科大学附属第二医院肝胆外科

陈辉，E-mail：wzyxych@163.com