对氧磷酶1过表达对敌敌畏急性中毒小鼠肝损伤保护作用的研究

陈晓宇 郭瑞娟 王菲 吴斌 洪广亮 赵光举 李萌芳 邱俏檬 卢中秋

对氧磷酶1过表达对敌敌畏急性中毒小鼠肝损伤保护作用的研究

陈晓宇 郭瑞娟 王菲 吴斌 洪广亮 赵光举 李萌芳 邱俏檬 卢中秋

目的 观察对氧磷酶1（PON1）过表达对敌敌畏中毒小鼠肝损伤的保护作用。方法 将96只Balb/c小鼠按随机数字表法分为正常对照组、敌敌畏染毒组、对照慢病毒（Lv-GFP）＋敌敌畏组和PON1过表达重组慢病毒（Lv-PON1）＋敌敌畏组，每组24只。Lv-GFP＋敌敌畏组、Lv-PON1＋敌敌畏组小鼠分别经尾静脉转染Lv-GFP、Lv-PON1第3天，连同敌敌畏染毒组小鼠腹腔注射敌敌畏溶液9mg/kg染毒，同时正常对照组给予等量0.9%氯化钠注射液。染毒后分别于6、12、24、48h各取6只小鼠麻醉处死，化学比色法检测血清乙酰胆碱酯酶（AChE）、ALT和AST活力，ELISA测定肝组织TNF-α和IL-1β水平，Western blot检测肝组织NF-κBp65表达，HE染色观察肝组织病理学变化。结果 与正常对照组比较，6、12、24h敌敌畏染毒组AChE活力下降及6、12、24、48h ALT、AST活力升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与相应时间点敌敌畏染毒组比较，Lv-PON1＋敌敌畏组AChE活力明显升高，ALT、AST活力明显降低（P＜0.05）。与正常对照组比较，6、12、24、48h敌敌畏染毒组TNF-α、IL-1β水平升高，NF-κBp65表达升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与相应时间点敌敌畏染毒组比较，Lv-PON1＋敌敌畏组TNF-α、IL-1β水平明显降低，NF-κBp65表达明显降低，除48h IL-1β外，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。光镜下可见，敌敌畏染毒组染毒后12h肝病理损伤明显，Lv-PON1＋敌敌畏组小鼠肝损伤较之有所减轻。结论 调控PON1过表达能够通过下调敌敌畏急性中毒小鼠肝组织NF-κBp65表达，减少TNF-α、IL-1β释放，减轻炎症损伤，对敌敌畏急性中毒小鼠肝损伤具有一定的保护作用。

敌敌畏 对氧磷酶1 肝损伤 炎症

急性有机磷农药中毒（acute organophosphorus poisoning，AOPP）可导致心、肺、脑、肝等重要器官功能损害，严重者可诱发机体发生全身炎症反应综合征（systemic innammatory response syndrome，SIRS），并进一步发展为多器官功能障碍综合征而导致死亡。虽然炎症反应与AOPP中毒后病情严重程度的关系复杂，但是炎症反应参与AOPP中毒引起的多器官功能损伤已得到广泛认可。肝脏作为有机磷代谢的主要器官，中毒患者可出现肝功能损伤而引发的肝功能衰竭。对氧磷酶1（PON1）具有抗氧化、抗炎、清除自由基等作用，并参与多种疾病的发展过程[1-3]。笔者通过建立敌敌畏急性中毒小鼠肝损伤模型，提前给予PON1过表达重组慢病毒进行干预，观察PON1过表达对敌敌畏急性中毒小鼠肝组织参与炎症反应的NF-κBp65及TNF-α、IL-1β表达的影响，探讨其对敌敌畏急性中毒小鼠肝损伤的保护作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂 敌敌畏（美国Sigma公司），乙酰胆碱酯酶（AChE）、AST、ALT试剂盒（南京建成生物工程研究所），TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒（美国R&D systems公司），RIPA裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术研究所），兔抗鼠NF-κBp65抗体（美国Abcam公司），化学发光剂（ECL）试剂盒（美国Thermo scientific公司）。PON1过表达重组慢病毒（Lv-PON1）和对照慢病毒（Lv-GFP）委托上海吉凯基因科技有限公司合成。

1.2 动物分组及处理 清洁级Balb/c雄性小鼠96只，体重18～22g，由温州医科大学实验动物中心代购提供。许可证号：SCXK（沪）2012-0002。PON1过表达重组慢病毒在正常小鼠体内的表达验证情况，均在本实验前期工作完成。现将96只清洁级Balb/c雄性小鼠按随机数字表法分为4组（每组24只）：正常对照组、敌敌畏染毒组、Lv-GFP＋敌敌畏组、Lv-PON1＋敌敌畏组。Lv-PON1＋敌敌畏组经尾静脉注射给予Lv-PON1 2×107TU，转染后第3天腹腔注射敌敌畏溶液9mg/kg；Lv-GFP＋敌敌畏组经尾静脉给予Lv-GFP 2×107TU，转染后第3天腹腔注射敌敌畏溶液9mg/kg；敌敌畏染毒组经尾静脉注射同病毒液等量的0.9%氯化钠注射液，第3天腹腔注射敌敌畏溶液9mg/kg；正常对照组经尾静脉注射同病毒液量的0.9%氯化钠注射液，第3天腹腔注射同敌敌畏溶液等量的0.9%氯化钠注射液。各组分别于6、12、24、48h取6只小鼠麻醉处死，留取血液、肝组织标本。血液于室温静置1h，4℃、5 000r/min离心15min，取上清液；肝组织经预冷的0.9%氯化钠溶液冲洗后立即转入液氮，-80℃保存。取肝脏同一部位，预冷的0.9%氯化钠注射液冲洗后置于4%多聚甲醛溶液中固定，进行肝组织病理学观察。

1.3 血清AChE、AST和ALT活力测定 按照试剂盒说明，化学比色法检测各组小鼠血清AChE、AST和ALT活力。

1.4 肝组织TNF-α、IL-1β水平测定 制备10%小鼠肝组织匀浆液，BCA法测蛋白浓度，按照试剂盒说明，ELISA法检测各组肝组织TNF-α、IL-1β水平。

1.5 肝脏组织NF-κBp65表达检测 取肝组织100mg，RIPA裂解液匀浆，BCA法测蛋白浓度，制备3%浓缩胶，10%分离胶，进行电泳、转膜、封闭，兔抗鼠NF-κBp65抗体（1∶1 000）、兔抗鼠GAPDH抗体（1∶5 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，10min/次，辣根过氧化物酶标记抗体山羊抗兔抗体（1∶5 000）室温下摇床孵育1h，TBST洗膜3次，10min/次，ECL显影，曝光。结果用凝胶成像分析系统显示，用Quantity one软件进行灰度值分析。

1.6 肝组织病理观察 4%多聚甲醛固定液中保存的肝组织，脱水和包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织病理变化。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 各组小鼠临床表现比较 正常对照组小鼠反应灵敏，呼吸平稳，皮毛光滑，活动自如，未见异常。敌敌畏染毒组小鼠在染毒后5min内即出现流泪、流涎，腹泻，呼吸急促，步态不稳，肌肉震颤，蜷缩成团，精神萎靡，随时间的延长症状逐渐缓解。Lv-PON1＋敌敌畏组小鼠染毒后中毒症状较敌敌畏染毒组有所减轻。Lv-GFP＋敌敌畏组与敌敌畏染毒组相比小鼠的中毒症状无明显区别。

2.2 各组小鼠肝组织病理学变化比较 正常对照组小鼠肝组织结构基本正常，肝细胞排列整齐呈索状并以中央静脉为中心向外辐射；敌敌畏染毒组染毒后6、12、24、48h肝组织结构破坏，肝细胞肿胀变形、排列紊乱，可见红细胞明显渗出，其中12h肝组织损害变化最为显著；Lv-PON1＋敌敌畏组的肝细胞结构损害、充血渗出较敌敌畏染毒组有所减轻，详见图1（见插页）。

2.3 各组小鼠血清AChE、AST和ALT活力的比较与正常对照组比较，敌敌畏染毒组6、12、24h AChE活力均受到抑制，均明显低于正常水平（均P＜0.05），但48hAChE活力无统计学差异（P＞0.05），6、12、24、48h AST、ALT活力均明显升高（均P＜0.05）；与敌敌畏染毒组比较，Lv-PON1＋敌敌畏组6、12、24h AChE活力抑制程度均明显减轻（均P＜0.05），但48h AChE活力无统计学差异（P＞0.05），6、12、24、48h AST、ALT活力均明显降低（均P＜0.05），Lv-GFP＋敌敌畏组AChE、AST、ALT在各时点与敌敌畏染毒组比较均无统计学差异（均P＞0.05），详见表1。

表1 各组小鼠血清AChE、AST和ALT活力的比较

2.4 各组小鼠肝组织TNF-α、IL-1β水平的比较 正常对照组TNF-α和IL-1β处于正常低水平。与正常对照组比较，敌敌畏染毒组小鼠肝组织TNF-α、IL-1β均明显升高，随时间逐渐下降，但依然高于正常对照组水平。与敌敌畏染毒组比较，Lv-PON1＋敌敌畏组在6、12、24、48h肝组织TNF-α水平均明显下降，差异均有统计学差异（均P＜0.05），IL-1β水平在6、12、24h均明显下降（均P＜0.05），但48h IL-1β变化无统计学差异（P＞0.05），Lv-GFP+敌敌畏组各时点TNF-α、IL-1β水平比较均无统计学差异（均P＞0.05），详见表2。

表2 各组小鼠肝组织TNF-α、IL-1β水平的比较

2.5 各组小鼠肝组织NF-κBp65表达的比较 与正常对照组相比，敌敌畏染毒组6、12、24、48h肝脏组织中NF-κBp65水平明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与敌敌畏染毒组相比，除48h外，Lv-PON1+敌敌畏组其余时点NF-κBp65表达明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），Lv-GFP+敌敌畏组各时点NF-κBp65表达均无统计学差异（均P＞0.05），详见表3，图2。

3 讨论

有机磷农药迄今还是应用广泛的杀虫药，由于自服、误服或防护不当等原因发生急性中毒事件屡见不鲜[4]。血清AChE活力水平作为评价有机磷中毒严重程度及预后的常用可靠标志，在临床诊治中有重要的意义。本研究结果表明，敌敌畏染毒组染毒后各组AChE活力明显低于正常水平，而PON1过表达重组慢病毒干预后小鼠血清AChE活力受抑程度逐渐减轻，说明上调PON1活性可以减轻AChE活力抑制程度，这与Wang等[5]的研究结果相一致。肝脏作为有机磷代谢的主要器官，有机磷化合物进入机体后主要分布在肝组织，可对肝脏进行直接毒害。血清AST和ALT活力升高是反应急性肝损伤的重要指标[6]。本研究发现，敌敌畏染毒后各组小鼠血清AST和ALT活力均明显升高，PON1过表达重组慢病毒干预后血清AST和ALT水平明显降低，结合肝组织病理学变化，说明调控PON1基因可减轻敌敌畏急性中毒导致的肝损伤。

表3 各组小鼠肝组织NF-κBp65/GAPDH灰度值比较

图2 各组小鼠肝组织NF-κBp65电泳图（1：正常对照组；2：敌敌畏染毒组；3：Lv-GFP＋敌敌畏组；4：Lv-PON1＋敌敌畏组）

有机磷农药进入机体后刺激体内免疫炎症系统，释放大量的炎症因子[7]，导致组织损伤进一步加重。AOPP患者血清TNF-α、IL-6等炎症水平明显升高，且中毒越严重其升高程度越明显[8-9]。TNF-α是炎症反应过程中出现最早，也是非常重要的介质之一，不仅可以活化中性粒细胞和淋巴细胞，还可以诱导IL-1β的表达，促进T淋巴细胞分泌TNF-α；同时，TNF-α可以触发NF-κB信号通路的激活，由于TNF-α启动子上含有NF-κB的结合位点，所以NF-κB可以反过来调节TNF-α的表达。NF-κB是参与炎症反应的核转录因子，正常生理状态下NF-κB主要与IκB（抑制蛋白）存在于真核细胞的胞质中，当受到应激原的刺激，NF-κB与IκB分离移位进入胞核，与靶基因NF-κB结合位点相结合，迅速诱导靶基因mRNA的合成，开启炎症因子的转录表达，从而参与免疫炎症反应的调节[10]。有研究证实，在TPA诱导的大鼠皮肤炎症模型中，结合PEP-1-PON1可以抑制NF-κBp65通路的活化，使TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平降低，改善炎症损伤[11]。本研究中，正常对照组中肝组织TNF-α、IL-1β水平处于低水平，敌敌畏染毒组肝组织TNF-α、IL-1β水平明显高于正常对照组，说明急性敌敌畏中毒肝损伤过程存在炎症反应，PON1过表达重组慢病毒干预后TNF-α、IL-1β随时间逐渐下降。提示PON1过表达可以降低炎症因子水平，抑制炎症反应。除此，PON1过表达重组慢病毒干预后NF-κBp65表达较敌敌畏染毒组降低。

PON1发挥抗炎作用的机制目前尚不清楚，本研究探索PON1与NF-κB及其下游因子之间的关系可能仅仅是其抗炎机制中的一小部分，PON1在NF-κB通路中主要和具体的作用靶点有待于进一步的研究；另外，还需要进行体外实验的观察和研究，这将对本实验具有一定的指导意义。

综上所述，调控PON1过表达能够缓解AChE抑制，降低肝功能指标AST、ALT水平，并可能通过NF-κBp65通路减少炎症因子TNF-α、IL-1β的释放，降低炎症水平，减轻肝损伤。本文从直接和间接两个方面阐述了PON1基因过表达对敌敌畏中毒导致的肝损伤具有一定的保护作用，为AOPP的预防提供了新思路和新方向。

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Over-expression of PON1 protects mice from dichlorvos poisoning-induced liver injury

CHEN Xiaoyu,GUO Ruijuan,WANG Fei，et al.Department of ICU,Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University,Taizhou 318020,China

Objective To investigate the effect of over expression of paraoxonase 1 gene(PON1)on inflammation and liver injury induced by dichlorvos(DDVP)poisoning in mice. Methods Ninety six Balb/c mice were randomly divided into 4 groups: normal control group,the dichlorvos poisoning group(9 mg/kg dichlorvos),blank lentivirus group(Lv-GFP+dichlorvos)and PON1 recombinant lentivirus group(Lv-PON1+dichlorvos)with 24 mice in each group.The Lv-GFP,Lv-PON1 were transfected to mice via tail vein in Lv-GFP and Lv-PON1 groups and 9 mg/kg dichlorvos solution were intraperitoneal injected to mice 3 days after transfection,while same amount of saline solution was given to normal control group.At 6 h,12 h,24 h,48 h after dichlorvos injection,6 mice were sacrificed in batch.Serum acetylcholinesterase(AChE),alanine aminotransferase (ALT)and aspartate transaminase(AST)were measured with chemical colorimetry.The levels of tumor necrosis-α(TNF-α)and interleukin 1β(IL-1β)in liver tissue were determined by enzyme-linked immunosorbent(ELISA).The expression of NF-κBp65 in liver tissue was detected by Western blot.The pathological changes of liver tissue were observed with HE staining. Results Compared with normal control group,the AChE activity decreased and ALT,AST activity increased at 6 h,12 h,24 h after dichlorvos injection (P＜0.05).Compared to dichlorvos group at corresponding time points,the AChE activity of Lv-PON1+dichlorvos group was significantly increased,and ALT,AST activity significantly decreased(P＜0.05).Compared with normal control group,the TNF-α, IL-1β,and NF-κBp656 levels in dichlorvos group at 6 h,12 h,24 h,48 h were elevated(P＜0.05).Compared with dichlorvos group at corresponding time points,the TNF-α,IL-1β levels and NF-κBp65 expression in Lv-PON1+dichlorvos group were significantly decreased(P＜0.05),expect the IL-1β expression in 48h.Compared with the Lv-PON1+dichlorvos group,liverinjury in dichlorvos group at 12h were significantly severe. Conclusion Over expression of PON1 can reduce inflammation and protect the liver injury induced by acute dichlorvos poisoning in mice,which is associated with down-regulation of NF-κBp65 expression and reduced TNF-α,IL-1β levels.

Dichlorvos PON1 Liver injury Inflammation

2015-07-06）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省“十二五”重点学科建设计划资助；浙江省中医药重点学科建设计划（2012-XK-A28）；浙江省医学创新学科建设计划（11-CX26）

318020 温州医科大学附属黄岩医院ICU（陈晓宇）；温州医科大学附属第一医院急诊医学中心（郭瑞娟、王菲、吴斌、洪广亮、赵光举、李萌芳、邱俏檬、卢中秋）

卢中秋，E-mail：lzq640815@163.com