右美托咪啶抑制NF-κB活化减轻肢体缺血再灌注损伤的研究

郑艳雅 温新意 袁培根 林丽娜 倪纯珏 赵喜越

右美托咪啶抑制NF-κB活化减轻肢体缺血再灌注损伤的研究

郑艳雅 温新意 袁培根 林丽娜 倪纯珏 赵喜越

目的 探讨右美托咪啶预处理对抑制NF-κB活化及减轻肢体缺血再灌注损伤的影响及机制。方法 将21只成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、缺血再灌注+右美托咪啶预处理组（DEX组），每组各7只。DEX组在麻醉后腹腔注射右美托咪啶25μg/kg，其余两组给予相应体积的0.9%氯化钠溶液，30min后单侧股部切口，无创动脉夹夹闭股动脉，用橡皮筋以恒定张力结扎该侧肢体，Sham组仅行股部手术、分离股动脉不夹闭，其余两组缺血3h后去除动脉夹及橡皮筋。采用ELISA法检测血清IL-1、IL-6、TNF-α，Western blot检测胞核NF-κB，光镜观察腓肠肌形态，并测定湿/干重比值。结果 显微镜下可见Sham组大鼠腓肠肌肌纤维排列整齐、间质少有炎性细胞浸润，I/R组大鼠腓肠肌肌纤维排列紊乱并出现明显水肿、间质中出现大量炎症细胞，DEX组大鼠腓肠肌肌纤维排列欠规则、间质中有少量炎性细胞，但较I/R组有所好转。与Sham组相比，I/R组湿/干重比值、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB水平均明显升高（均P＜0.05）；与I/R组相比，DEX组湿/干重比值、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB水平均明显降低（均P＜0.05）。结论 右美托咪啶可抑制NF-κB信号通路活化，减轻肢体缺血再灌注损伤。

缺血/再灌注损伤 NF-κB 右美托咪啶

肢体缺血再灌注损伤是指肢体在缺血一段时间后恢复血流灌注，骨骼肌的损伤不但没有减轻反而有所加重。肢体缺血再灌注损伤在临床上比较常见，如腹主动脉手术、断肢再植、远端血管重建术等均会造成一定程度的肢体缺血再灌注损伤[1]。因此，寻找有效的治疗手段来预防或减轻缺血再灌注损伤具有重要意义。近年来，随着对右美托咪啶研究的深入，发现其不仅具有镇静、镇痛、抗焦虑、抗交感活性和稳定血流动力学的特点[2]，在心[3]、肺[4]等重要器官的缺血再灌注损伤中均有一定的保护作用，Xu等[5]发现右美托咪啶对肢体缺血再灌注损伤也有保护作用，这与其抗氧化抗炎作用有关，但对于其器官保护作用具体机制尚未明确。有报道指出肢体缺血再灌注后，机体的NF-κB信号通路被激活，进而促发一系列的炎症因子产生，导致骨骼肌因炎症反应而发生损伤[6]，这也是造成缺血再灌注损伤的一个重要因素。本研究通过观察肢体缺血再灌注损伤后大鼠的NF-κB及其相关炎症因子的变化，以及右美托咪啶对NF-κB信号通路活化和肢体缺血再灌注损伤的影响，初步探讨右美托咪啶对大鼠肢体缺血再灌注损伤的保护机制，为临床预防和治疗肢体缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点及途径。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠21只，SPF级，体重280～320g；由温州医科大学实验动物中心提供。低温离心机、酶标仪（美国Thermo公司）；垂直电泳系统（美国BIO-RAD公司）；显微镜（日本Olympus公司）；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；IL-1、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒（上海西塘生物科技有限公司）；胞质胞核蛋白提取试剂盒（普利莱基因技术有限公司）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗IgG（英国Abcam公司）；核内参TBP（美国Bioworld Technology公司）；BCA Protein Assay Kit（美国Thermo公司）；右美托咪啶注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司）。

1.2 动物模型的建立与分组 按随机数字表法将21只SD大鼠分为假手术组（Sham组）、肢体缺血再灌注组（I/R组）、肢体缺血再灌注+右美托咪啶预处理组（DEX组）3组，每组7只。将25%乌拉坦和10%水合氯醛1:1混合液5ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠眼睫毛反射和刺激下肢反射消失后，右下肢股部切口分离股动、静脉，用无创动脉夹夹闭，用橡皮筋穿过动、静脉，以恒定张力环扎该侧肢体，观察到大鼠该侧肢体由红润色变成暗紫色，说明缺血成功；夹闭3h后松开动脉夹及橡皮筋恢复血供，2h后将大鼠取血、处死，并取该侧腓肠肌检测。DEX组缺血前30min腹腔注射右美托咪啶25μg/kg，其它两组给予相应体积的0.9%氯化钠溶液，Sham组仅行股动、静脉分离术不夹闭。

1.3 腓肠肌湿/干重比值测定 切取腓肠肌，即刻称取湿重，然后置于55℃恒温干燥箱中至恒重即为干重，采用湿重与干重的比值来反映腓肠肌的水肿程度。

1.4 腓肠肌形态观察 腓肠肌置于10%多聚甲醛中固定24h，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察腓肠肌组织形态变化。

1.5 ELISA法检测血清IL-1、IL-6、TNF-α水平 依照试剂盒说明书分别采用抗大鼠IL-1、IL-6、TNF-α单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-1、IL-6、TNF-α与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IL-1、IL-6、TNF-α，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，通过绘制标准曲线得到IL-1、IL-6、TNF-α水平。

1.6 Western blot检测腓肠肌NF-κB的表达 依照试剂盒说明书提取胞核蛋白，采用BCA法测定浓度。蛋白在10%SDS-PAGE中室温电泳分离，NF-κB（300mA、70min）湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加NF-κB（稀释度1∶2 000）和TBP（稀释度1∶500）一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，10min/次，加入生物素标记的二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，10min/次，ECL化学发光法覆盖条带，暗室中显影、定影，将胶片冲洗后晾干。胶片扫描后，采用Image J测定各目的条带的吸光度（A）值，并以目的蛋白和相应内参的A值比值表示目的条带相对强度。

1.7 统计学处理 应用SPSS 20统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnet′t检验。

2 结果

2.1 各组腓肠肌湿/干重比值的比较 Sham组湿/干重比值较小；与Sham组比较，I/R组骨骼肌湿/干重比值明显升高（P＜0.05）；与I/R组比较，DEX组湿/干重比值降低（P＜0.05），详见表1。

表1 各组腓肠肌湿/干重比值的比较

2.2 各组腓肠肌形态变化 横切面观察发现：Sham组，肌纤维呈多边形结构规则排列，未见细胞肿胀，间质结构正常，血管周围未见明显炎症细胞渗出；I/R组细胞排列不规则，染色明显变淡、界限不清晰，细胞肿胀明显，间质见弥散的红细胞，血管周围可见大量炎症细胞浸润；DEX组细胞排列欠规则，细胞染色稍有变淡、界限欠清晰，间质偶见红细胞，血管周围有少量炎性细胞浸润，但与I/R组相比有明显好转，详见图1。

图1 各组骨骼肌的病理改变（a：Sham组；b：I/R组；c：DEX组；HE染色，×400）

2.3 各组血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的比较 Sham组IL-1、IL-6、TNF-α水平较低；与Sham组相比，I/R组IL-1、IL-6、TNF-α水平均明显升高（均P＜0.05）；与I/R组相比，DEX组IL-1、IL-6、TNF-α水平均明显降低（均P＜0.05），详见表2。

表2 各组血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的比较（pg/ml）

2.4 各组腓肠肌NF-κB表达的比较 Sham组胞核NF-κB电泳条带A值与内参TBP电泳条带A值的比值较小；与Sham组比较，I/R组胞核NF-κB A值与内参A值得比值升高（P＜0.05）；与I/R组比较，DEX组胞核NF-κB A值与内参A值的比值显著降低（P＜0.05），详见表3。

表3 各组骨骼肌NF-κB表达的比较

3 讨论

本实验通过常用阻断血管的方法成功制作了肢体缺血再灌注损伤模型，进一步证实了右美托咪啶对肢体缺血再灌注损伤有保护作用，这与文献报道相一致[5,7]。同时笔者也发现，右美托咪啶可以下调肢体缺血再灌注损伤后的NF-κB核内转移，使相关炎症因子生成减少，减轻肢体缺血再灌注所造成的损伤。

肢体缺血再灌注损伤是临床诊疗中不可忽视的一个问题，越来越多的证据显示炎症反应在肢体缺血再灌注损伤中起到了举足轻重的作用，而IL-1、IL-6、TNF-α等大量炎症因子的释放是炎症反应发生、发展的关键[8]，同时作为转录因子NF-κB的激活是上述基因表达的前提。随着研究的深入，NF-κB对炎性分子转录的调控、在细胞凋亡中的作用逐渐引起人们重视。目前已经证实，NF-κB的结合序列存在于多种基因的启动子区域，包括IL-1、IL-6、TNF-α等[9]。目前发现哺乳动物中NF-κB家族的亚单位有5种：Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel（Rel）、NF-κB1（p105/p50）和NF-κB2（p100/p52），Western blot检测的具体是针对亚基为Rel-A（p65）。它们通常以同源二聚体或异源二聚体非活性形式与其抑制蛋白I-κB形成复合物，存在于几乎所有类型细胞的胞质。当I-κB磷酸化、被蛋白酶降解，NF-κB会从NF-κB-I-κB复合物中解离出来并转位于细胞核，与相应的靶基因结合[10]。本研究发现，I/R组较Sham组NF-κB表达增多（P＜0.05），这与文献报道相一致[6]，同时还发现，DEX组大鼠较I/R组NF-κB表达降低（P＜0.05），这说明右美托咪啶可以减少NF-κB的核内转移。

IL-1由激活的巨噬细胞及几乎所有的有核细胞产生，可促发多种体内炎症反应如发热、血管阻力降低、毛细血管通透性增加等；IL-6为巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞所分泌的一种炎症介质且能被IL-1和TNF-α所诱导，是急性期反应的主要细胞因子[11]；TNF-α是主要由单核细胞和巨噬细胞产生的一种单核因子，是肢体缺血再灌注损伤过程中的始动因子[8]，可提高中性粒细胞的吞噬能力，刺激内皮细胞对IL-1、IL-6的分泌[12]，并促进中性粒细胞和内皮细胞的黏附，进而促进机体局部炎症反应及组织损伤的扩大。本研究发现，与Sham组相比，I/R组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明显增高（P＜0.05），表现为缺血腓肠肌的湿/干重比值明显增多（P＜0.05），而与I/R组相比，DEX组IL-1、IL-6、TNF-α水平及湿/干重比值均明显降低（均P＜0.05）。同时HE染色发现，Sham组肌纤维排列整齐、间质少有炎性细胞浸润，I/R组肌纤维排列紊乱并出现明显水肿、间质中出现大量炎症细胞，DEX组肌纤维排列欠规则、间质中有少量炎性细胞，但较I/R组有所好转。

综上所述，右美托咪啶可以减少肢体缺血再灌注损伤骨骼肌NF-κB的核内转移，促使 IL-1、IL-6、TNF-α在内的炎症因子生成减少，降低肢体缺血再灌注后骨骼肌的损伤。

[1]Duehrkop C,Bznz Y,Spirig R,et al.C1 Esterase Inhibitor Reduces Lower Extremity Ischemia/Reperfusion Injury and Associated Lung Damage[J].PLoS One,2013,8(8):e72059.

[2]Gu J,Chen J,Tao G,et al.Dexmedetomidine attenuates remote lung injury induced by renalischemia-reperfusion in mice[J].Acta AnaesthesiolScand,2011,55(10):1272-1278.

[3]Soichiro M,Takasumi K,Akira S,et al.Deterioration of myocardial injury due to dexmedetomidine administration after myocardial ischaemia[J].Resuscitation,2010,81(12):1714-1717.

[4]Jiang Lili,Li L i,Shen Jinmei,et al.Effect of dexmedetomidine on lung ischemia?reperfusion injury[J].MolMed Reports,2014,9(2): 419-426.

[5]Xu Dong,Xing Quanzhi,Li Yu,et al.Dexmedetomidine protects against ischemia-reperfusion injury in rat skeletal muscle[J].J Surg Res,2014,186(1):240-245.

[6]杨军,胡新华,张强,等.核因子κB在大鼠双侧后肢缺血再灌注所致肺损伤中的表达及意义[J].中国医科大学学报，2004,33(1):9-11.

[7]Zhang Xuyu,Liu Zimeng,Wen Shihong,et al.Dexmedetomidine administration before,but not after,ischemia attenuates intestinal injury induced by intestinal ischemia-reperfusion in rats[J]. Anesthesiology,2012,116(5):1035-1046.

[8]张江锋,覃晓,李喆,等.大鼠肢体缺血再灌注不同时段相关炎性介质的表达[J].中外医学研究,2011,9(2):1-3.

[9]Zhang L,Zhang J,Yang L,et al.Isoflurane and sevoflurane increase interleukin-6 levels through the nuclear factor-kappa B pathway in neuroglioma cells[J].Br J Anaesth,2013,110(1): i82-i91.

[10]Huang Y,Lu Y,Zhang L,et al.Perineural Dexmedetomidine Attenuates Inflammation in Rat Sciatic Nerve via the NF-κB Pathway[J].Int J MolSci,2014,15(3):4049-4059.

[11]徐余兴,刘斌,朱华刚,等.下肢深静脉血栓形成急性期C-反应蛋白、IL-6、IL-8及纤维蛋白原的作用研究[J].安徽医科大学学报, 2012,47(4):471-473.

[12]Studer R K,Vo N,Sowa G,et al.Human nucleus pulposus cells react to IL-6:independent actions and amplification of response to IL-1 and TNF-α[J].Spine,2011,36(8):593-599.

Dexmedetomidine reduces ischemia-reperfusion injury in skeletal muscle via suppressing activation of NF-κB

ZHENG Yanya,WEN Xinyi，YUAN Peigen,et al.Department of Anesthesiology,Wenzhou People's Hospital,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of dexmedetomidine (DEX)on skeletal muscle injury induced by ischemia-reperfusion and related mechanisms. Methods Twenty-one SD rats were randomly divided into sham-operated group(sham group),ischemia-reperfusion(I/R)group and I/R+DEX group.In DEX group,DEX(25μg/kg)was injected after anesthesia;while in the other groups,the same volume of saline was also injected.After 30 minutes,the hind limb ischemia was induced by clamping the common femoral artery and ligating collateral circulation.After 3h of ischemia,the clamp and tourniquet were removed and the rats underwent reperfusion for 2h.The plasma concentrations of IL-1,IL-6 and TNF-α were measured with enzyme-linked immunosorbent assay.The gastrocnemius muscle was harvested,the expression of NF-κB protein was detected by Western blot;the morphological changes were observed with HE staining;the wet/dry ratio was also measured. Results The intact muscle fiber and few inflammatory cells infiltration in interstitial space were observed with light microscopy in sham group.Disordered arrangement and edema of muscle fibers and interstitial inflammatory cells infiltration were showed in I/R group.In DEX group,the disordered arrangement of muscle fiber and infiltration of inflammatory cells in the stroma were attenuated as compared to I/R group.The wet/dry ratio,plasma levels of TNF-α and NF-κB were higher in I/R group than those in sham group(P＜0.05).The wet/dry,plasma IL-1,IL-6,TNF-α levels and NF-κB expression were significantly lower in DEX group than those in I/R group(P＜0.05). Conclusion Dexmedetomidine can reduce the ischemia-reperfusion injury of skeletal muscle,which is associated with the inhibition of NF-κB activation.

Reperfusion injury NF-κB Dexmedetomidine

2015-10-16）

（本文编辑：严玮雯）

温州市科技计划项目（Y20140561）

325000 温州医科大学温州市第三临床学院、温州市人民医院麻醉科（郑艳雅、温新意）；温州医科大学附属第一医院麻醉科（袁培根、林丽娜、倪纯珏、赵喜越）

赵喜越，E-mail：544649314@qq.com