糖类化合物PMP衍生分析进展

张璐瑶，赵 峡，陈欢欢

(中国海洋大学 医药学院，海洋药物教育部重点实验室，山东省糖科学与糖工程重点实验室，山东 青岛 266003)



糖类化合物PMP衍生分析进展

张璐瑶，赵 峡*，陈欢欢

(中国海洋大学 医药学院，海洋药物教育部重点实验室，山东省糖科学与糖工程重点实验室，山东 青岛 266003)

糖类物质的结构与组成分析在揭示其生物学功能方面发挥着重要作用，糖类化合物的衍生化分析是实现其高灵敏度定性和定量检测的有效方法。该文对一种条件温和、灵敏度高、选择性好的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的衍生化分析方法在糖类化合物的单糖组成、聚合度、取代度、异构体分析以及在N/O-糖链的释放和定量分析等方面的应用进展进行了综述。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)；衍生化方法；糖类分析；综述

生物体内的糖类物质已被证明具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等重要的生物活性，对糖类进行定性定量分析研究有助于探索糖类生物学功能以及相关疾病的发病机理[1]。然而由于糖类物质极性大，缺乏光学吸收基团，无法满足高灵敏度分析手段的检测要求，糖类分析手段成为制约整个糖类研究领域发展的瓶颈[2]。衍生化可使糖链带上紫外或荧光基团，在满足高灵敏度光学检测的同时提高离子化效率，为糖类物质的分析提供了新的技术。常用的衍生化试剂有紫外和荧光两种[3]，在众多的衍生试剂中，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为代表的1,3取代的吡唑啉酮类衍生试剂和糖链还原性末端的反应在弱碱性介质中进行，与其它在酸性介质中反应的衍生试剂相比，具有条件温和、衍生产物稳定、无立体异构体、紫外吸收强、不损失唾液酸、适于多种类型糖链分析等优点，被广泛应用于糖类化合物的分析[4]。PMP类似物如1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)[5-6]、1-(4-异丙基)苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PPMP)[7]、1,3-二苯基-5-吡唑啉酮(DPP)[8]及1-(甲氧苯基)-3-甲基-吡唑啉酮(PMPMP)[9]等对分析痕量甚至微痕量糖链也均有明显优势，具有较高的开发潜力。本文对PMP衍生化方法在糖类化合物的单糖组成分析、寡糖聚合度和取代度分析、二糖异构体的区分、N-糖链和O-糖链的释放及定量分析等方面的研究进展进行了系统的总结，以期为研究者在糖类化合物的高灵敏度定性、定量分析方面提供启发和借鉴。

1 PMP衍生化反应的机理、方法与特性

还原糖与PMP的衍生反应在碱性条件下进行，其1个糖分子的还原端可与2分子PMP形成稳定的衍生物。以PMP与葡萄糖的衍生为例，其衍生反应机理如图1所示。常用的典型衍生方法[10]为：向100 μL供试品溶液中加入100 μL 0.3 mol/L NaOH和120 μL 0.3 mol/L PMP溶液，充分混合，在70 ℃下避光反应1 h，冷却至室温后用100 μL 0.3 mol/L HCl中和，再用500 μL氯仿反复萃取3次，离心后取上清液即可用于色谱或质谱分析。若用氨水代替NaOH作反应介质，无需盐酸中和，经真空干燥后可直接进行质谱分析，从而可简化反应步骤，减少微量样品的损失并提高质谱信号的灵敏度[11]。

图1 PMP与还原糖的衍生反应机理以及PMP衍生物在弱碱性条件下的复原Fig.1 Derivatization mechanism of reducing sugar with PMP and recovery of the PMP derivative in weakly alkaline condition

糖与PMP的衍生产物具有两个重要特点：①在紫外区(UV)具有强吸收，如PMP标记的葡萄糖乙醇溶液在245 nm处的摩尔吸光系数可达29 400；②可使大部分糖类化合物的电化学反应性能明显提高[12]，如PMP标记的葡萄糖可在玻碳电极上氧化产生600 mA电流，可以实现在毛细管电泳(CE)分析中的高灵敏度检测[10,13]。此外，糖类的PMP衍生物虽在碱性且低温条件下保持稳定，但在弱碱性条件下加热可使糖类复原，如PMP标记的葡萄糖在弱碱溶液中加热时，1个PMP基团首先被移除，形成1-PMP衍生物；在更激烈的条件下可移除另1个PMP。这不仅可将PMP衍生物恢复为原先的糖，还可用于糖类的结构确证和酶的抑制分析等[14]。据此特性可在PMP衍生完成后，利用萃取等手段除去PMP，以防止糖的复原。

2 单糖组成分析

单糖组成分析是多糖基本结构解析的重要手段。因为糖类物质不具有发色基团，且单糖极性较强，结构相近，难以用常规方法进行分析。采用PMP衍生化方法可使糖类物质在245 nm处产生强烈的紫外吸收，检测灵敏度可达到1 pmol甚至100 fmol[12]，并具有操作方便、分离效率高、重现性好等特点，是目前糖类物质，尤其是复杂糖类物质单糖组成分析的重要方法[15-16]。

通过采用PMP衍生法可实现对中性糖如甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)，酸性糖如葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)，碱性糖如氨基葡萄糖(GlcN)、氨基半乳糖(GalN)共11种单糖的同时测定[15]。本实验室的研究结果表明，这些常见单糖中除Ara/Xyl外，均可实现良好的基线分离(见图2)。另外，本实验室还将PMP衍生方法成功用于褐藻多糖及海洋抗心血管疾病药物藻酸双酯钠(PSS)中甘露糖醛酸(M)/古罗糖醛酸(G)的组成比例分析(见图3)[17]，因该方法是在碱性条件下衍生，糖醛酸的内酯形式不影响M和G的分离，比传统的离子交换色谱方法更适合M/G比值的测定和产品的质量控制。此外，PMP衍生法还可同时对酵母细胞壁中的露聚糖和β葡聚糖含量进行测定[18]，以及对传统中药中的多糖进行PMP衍生单糖组成分析并建立HPLC指纹图谱，从而为中药多糖结构分析和质量控制提供了有力依据[19]。

图2 常见11种单糖标准品PMP衍生物的液相色谱图[15]Fig.2 Chromatogram of eleven monosaccharide standards derivatized by PMP[15]1.Man;2.GlcN;3.Rha;4.GlcUA;5.GalUA;6.GalN; 7.Glc;8.Gal;9.Xyl;10.Ara;11.Fuc

图3 古罗糖醛酸标准品(a)、甘露糖醛酸标准品(b)以及PSS样品(c)的液相色谱图[17]Fig.3 Chromatograms of α-L-guluronic acid(a) , β-D-mannuronic acid(b)and PSS(c)[17]

图4 PMP衍生的麦芽寡糖混合物的HPLC分离图[22]Fig.4 Chromatogram of the PMP derivatives of maltodextrins[22]

3 寡糖聚合度及取代度的分析

寡糖的生物活性与其聚合度(DP)密切相关，不同DP值的寡糖分子可产生不同的生物活性[20-21]，因此寡糖的DP分析在其构效关系研究和产品质量控制方面具有重要意义。研究表明，寡糖经PMP 衍生化后采用RP-HPLC 分离模式，可以有效地应用于寡糖的DP测定。如对麦芽寡糖混合物采用PMP标记后，在50 min 内可以基线分离DP 1-16 的麦芽寡糖(图4)[22]。

寡糖的取代基位置和取代度均会明显影响其生物活性，采用PMP衍生化方法可以测定寡糖的取代度和判断取代位置。壳聚糖和甲壳素的差异在于糖链中的乙酰化程度(DA)不同，采用Hirano法将壳聚糖的亚硝酸降解产物进行PMP衍生和LC-MS分析，可测定壳寡糖中自由氨基和N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)的含量及DA值[23]。如图5所示，质荷比(m/z)1 100.42为带有3个GlcNAc的寡糖，m/z752.78为带有5个GlcNAc的寡糖。该方法可检测到DP高达11的壳寡糖，根据紫外信号进行定量计算得到DA为32%，与酸碱滴定法测定结果一致。另外，PMP衍生方法还可用于硫酸寡糖取代位置和取代度的分析。如采用PMP衍生法将硫酸软骨素A(UA-GalNAc4S)、硫酸软骨素B(UA2S-GalNAc4S)以及硫酸软骨素C(UA-GalNAc6S)的亚硝酸降解产物采用联合二级质谱技术进行分析，不仅能够确认二糖硫酸基团位置，而且可以分析得到硫酸寡糖的取代度[24-25]。

4 二糖的同分异构体分析

糖类的同分异构体，尤其是不同糖苷键或端基异构体很难采用常规分析方法加以区分，但通过PMP衍生化并结合多级质谱(MSn)产生的离子碎片和相对丰度情况，可以区分不同连接方式的糖以及糖的α和β异构体。如 Wan等[26]通过采用PMP衍生和MSn联用技术，研究了α1-2(曲二糖)、β1-2(槐糖)、α1-3(黑曲霉糖)、β1-3(海带二糖)、α1-4(麦芽糖)、β1-4(纤维二糖)、α1-6(异麦芽糖)、β1-6(龙胆二糖)8种二糖4对同分异构体，发现根据不同异构体产生的特定离子碎片和相对丰度比，可对其连接方式和构型加以区分。以1-3糖苷键连接为例，因α-糖环和β-糖环与PMP形成的C—C键能不同，黑曲霉糖(α1-3)的基峰m/z为 533，而海带二糖(β1-3)m/z为521；将丢失1个PMP基团的碎片(m/z521)进行MS3分析，可获得更多的碎片离子信息(表1)。如在MS3分析中，1-2糖苷键出现了m/z401特征离子；1-3糖苷键出现了m/z455，1-4糖苷键出现了m/z461，1-6糖苷键则出现m/z275特征离子等，可以对不同的连接方式加以区分。此外，本实验室还成功建立了利用PMP衍生高效液相色谱法分离糖胺聚糖(GAGs)中GlcN与氨基甘露糖(ManN)、GlcUA与艾杜糖醛酸(IdoA)的方法，并结合电喷雾二级质谱(ESI-CID-MS/MS)鉴定了GAGs中的耐酸解二糖[25]。

图5 PMP衍生的乙酰化壳寡胺的HPLC-MS总离子流图(A)及各峰对应的质量数(B)[23]

Fig.5 TIC chromatogram of the MS analysis of acetylated chitosan PMP derivatives(A) and the accumulatedm/zfor each peak(B)[23]

表1 4种不同连接方式二糖的特征离子碎片及区分异头物的特征峰[26]

Table 1 A set of empirical criteria showing the special fragment ions for the four different linked disaccharides and the selected characteristic peak pairs to discriminate the isomeric disaccharides with different anomeric configurations[26]

LinkageSpecialionsinMS2SpecialionsinMS3RelativeionabundanceGlc(1-2)Glc401401α533/343>1>β533/343Glc(1-3)Glc431455α533/521>1>β533/521Glc(1-4)Glc-461α533/521>1>β533/521Glc(1-6)Glc659，275275α533/305>1>β533/305

5 用于N-糖链及O-糖链的释放及定量分析

在细胞表面和糖蛋白中发现的N-糖链与O-糖链，在细胞间的通讯和相互作用方面发挥着重要作用，并与炎症、免疫性疾病、肿瘤等很多疾病的发生和发展密切相关。因此，N-/O-糖链的定性和定量分析在揭示糖链的生物学功能和与疾病的关系等方面具有重要意义[27]。

利用稳定同位素PMP衍生标记糖链的还原端，可实现对N-糖链和O-糖链[28]的相对定量分析。如将两种来源的N-糖链用PNGase F酶切释放，分别用氘代PMP(d0/d5-PMP)衍生后进行MS分析，发现同一糖链会出现分子量相差10 Da的对峰，由于同位素糖链之间的离子化效率相似，对峰之间丰度的差异可反映两种不同来源糖链在量上的差异，从而可实现对糖链的定性和定量分析。这种方法已成功用于牛胎球蛋白(Bovine fetuin)N-糖链的释放和分析(如图6)[29]。在等摩尔混合的d0/d5-PMP牛胎球蛋白N-糖链衍生物ESI-MS图[29]中，可以看到m/z2 118.09/2 128.36，2 263.09/2 273.36，2 554.18/2 564.36，2 628.36/2 638.45，2 919.45/2 929.45，3 210.36/3 220.64以及3 501.36/3 511.82共7组相差10 Da且丰度相当的对峰，通过解析可获得这些糖链的结构信息，并均与文献报道[30]相符。另外，在NaOH碱解条件下，利用PMP衍生带有核心α-1,3-岩藻糖基化的N-糖链，可以便捷地非还原性释放N-糖链，解决了PNGase F酶不能有效酶切此类N-糖链的难题[31]。

O-糖链的解离、纯化、分析也是糖组学研究中的重要内容。因尚未发现有效的内切酶，目前O-糖链的释放主要采用β-消除法，但该方法易造成糖链的还原端连续降解(即peeling反应)，使得O-糖链的收率较低。采用PMP衍生化反应可使解离下的O-糖链随即被PMP保护，可有效抑制peeling反应的发生[4,32-33]。如图7所示，解离下的O-糖链被PMP标记后，采用亲水作用色谱(HILIC)和RP-HPLC对中性或带唾液酸的糖链进行分离纯化，不仅无唾液酸的丢失，而且分析时间短，可应用于复杂O-糖链的定性和定量分析[34]。

图6 牛胎球蛋白 N-糖链的d0/d5-PMP衍生物等摩尔混合物的ESI-MS图[29]Fig.6 Mass spectrum of the equimolar mixture of d0-PMP-and d5-PMP-labeled N-glycans released from bovine fetuin by PNGase F[29]■GlcNAc(N-乙酰葡萄糖);○Man(甘露糖);□Gal(半乳糖);◆NeuNAc(N-乙酰神经氨酸); ▲Fuc(岩藻糖)

图7 PMP标记的牛胎球蛋白中O-糖链的HILIC(A)及RP-HPLC(B)色谱图[34]

Fig.7 HILIC(A) and RP-HPLC(B) chromatograms of PMP-labeled O-glycans derived from bovine fetuin[34]

6 结论与展望

PMP衍生化方法具有操作方便、条件温和、灵敏度高、产物无立体异构等优点，已被广泛应用于糖类化合物的高灵敏度定性与定量分析领域。PMP柱前衍生高效液相色谱法可同时检测多达11种单糖组成，可用于复杂多糖的结构组成分析；不同聚合度的寡糖经PMP衍生后可在色谱柱上得到更好的分离效果；采用PMP衍生和ESI-MSn联用，根据特定的离子碎片和相对丰度比，可以清晰地区分不同二糖异构体的连接方式和构型；利用d0/d5-PMP同位素标记可对糖链特别是对含有唾液酸的糖链进行相对定量分析；O-糖链与PMP衍生反应可实现糖链解离和标记同步进行，并可简化步骤、抑制peeling反应和增强质谱的检测灵敏度。随着色谱与质谱联用技术的不断进步，PMP衍生方法将得到更为广泛的应用和发展，可以预见，该方法将会进一步为复杂糖类化合物的结构鉴定和定量分析提供更好的技术支撑。

[1] Yang L Q,Zhang L M.Carbohydr.Polym.,2009,76(3):349-361.

[2] Wang C J，Wang Z F.Chin.Bull.LifeSci.(王承健，王仲孚.生命科学),2011,23(6):569-577.

[3] Xu J，Zhang Q H，Zhang W B，Wang F Y，Li T.Chin.J.Chromatogr.(徐瑾，张庆合，张维冰，王风云，李彤.色谱),2003,21(2):115-120.

[4] Honda S,Akao E,Suzuki S,Okuda K,Kakehi K,Nakamura J.Anal.Biochem.,1989,180(2):351-357.

[5] Ding C X,Wang L Y,Tian C L,Li Y L,Sun Z W,Wang H L,Suo Y R,You J M.Chromatographia,2008,68(11/12):893-902.

[6] You J M,Sheng X,Ding C X,Sun Z W,Suo Y R,Wang H L,Li Y L.Anal.Chim.Acta,2008,609(1):66-75.

[7] Zhang P,Wang Z F,Xie M M,Nie W L,Huang L J.J.Chromatogr.B,2010,878:1135-1144.

[8] Zhang P，Wang Z F，Huang L J.Chin.J.Synth.Chem.(张萍,王仲孚,黄琳娟.合成化学),2013,21:262-266.

[9] Kakehi K,Suzuki S,Honda S,Lee Y C.Anal.Biochem.,1991,199(2):256-268.

[10] Suzuki S,Yamamoto M,Kuwahara Y,Makiura K,Honda S.Electrophoresis,1998,19(15):2682-2688.

[11] Lin X，Wang Z F，Huang L J，Bai Q，Jia J F.ChemJ.Chin.Univ.(林雪，王仲孚，黄琳娟，白泉，贾敬芬.高等学校化学学报)，2006,27(8):1456-1458.

[12] Lattova E,Snovida S,Perreault H,Krokhin O.J.Am.Soc.MassSpectrom.,2005,16(5):683-696.

[13] Harvey D J.J.Chromatogr.B,2011,879(17/18):1196-1225.

[14] Honda S,Suzuki S,Taga A.J.Pharm.Biomed.Anal.,2003,30(6):1689-1714.

[15] Fu H N，Zhao X，Yu G L，Chen E G，Wen S S.Chin.J.Mar.Drugs(付海宁，赵峡，于广利，陈娥功，文松松.中国海洋药物)，2008,27(4):30-34.

[16] Zhang Y,Zhang P,Wang Z F,Huang L J.J.Liq.Chromatogr.RelatedTechnol.,2011,34:1754-1771.

[17] Wu J,Zhao X,Ren L,Xue Y L,Li C X,Yu G L.Carbohydr.Polym.,2014,104(15):23-28.

[18] Lin Q H，Zheng J G，Cai D C，Lin Y Y，Xia B，Zhang F.J.Instrum.Anal.(林钦恒，郑家概，蔡大川，林奕云，夏冰，张飞.分析测试学报)，2015,34(1):106-110.

[19] Wan Q，Wu X H，Fan H J，Luo A，Chen Z，Huang X W，Zhang W.J.Instrum.Anal.(万强，吴学昊，范华均，罗安，陈智，黄晓文，张薇.分析测试学报)，2014,33(11):1231-1236.

[20] Moreno F J,Montilla A,Villamiel M,Corzo N,Olano A.Electrophoresis,2014,35(11):1519-1534.

[21] Yuan J P，Li G H，Wang S M，Gao Y C.GuangdongAgric.Sci.(袁建平，李国辉，王淑敏，高勇闯.广东农业科学)，2012,39(8):107-109.

[22] Wang Z F，Zhang Y，Lin X，Huang L J.ActaChem.Sin.(王仲孚，张英，林雪，黄琳娟.化学学报)，2007,65(23):2761-2764.

[23] Han Z R,Zeng Y Y,Lu H,Zhang L J.Carbohydr.Res.,2015,413:75-84.

[24] Zhang L J，Han Z R，Zeng Y Y，Lan Y，Qiu P J.China Patent(张丽娟，韩章润，曾洋洋，兰莹，邱培菊.中国专利)，201310695277.6.[2014-04-02].

[25] Zhu H,Chen X,Zhang X,Liu L L,Cong D P,Zhao X,Yu G L.Anal.Biochem.,2014,465:63-69.

[26] Wan D B,Yang H M,Song F R,Liu Z Q,Liu S Y.Anal.Chem.Acta,2013,780(10):36-45.

[27] Rudd P M,Elliott T,Cresswell P,Wilson I A,Dwek R A.Science,2001,291(5512):2370-2376.

[28] Sic S,Maier N M,Rizzi A M.J.Chromatogr.A,2015,1408:93-100.

[29] Simoes J,Domingues P,Reis A,Nunes F M,Coimbra M A,Domingues M R M.Anal.Chem.,2007,79(15):5896-5905.

[30] Huang Y P,Konse T,Mechref Y,Novotny M V.RapidCommun.MassSpectrom.,2002,16(12):1199-1204.

[31] Yuan J B,Wang C J,Sun Y J,Huang L J,Wang Z F.Anal.Biochem.,2014,462:1-9.

[32] Wang C J,Yuan J B,Wang Z F,Huang L J,Wang Z F.J.Chromatogr.B,2013,1274:107-117.

[33] Zauner G,Koeleman C A M,Deelder A M,Wuhrer M.Biochem.Biophys.Acta,2012,1820:1420-1428.

[34] Wang C J,Fan W C,Zhang P,Wang Z F,Huang L J.Proteomics,2011,11(21):4229-4242.

Advance in 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) Derivatization Analysis of Carbohydrates

ZHANG Lu-yao,ZHAO Xia*,CHEN Huan-huan

(Key Laboratory of Glycoscience and Glycotechnology of Shandong Province,Key Laboratory of Marine Drugs of Education Ministry,School of Medicine and Pharmacy,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The structural research and composition analysis of carbohydrates play important roles in disclosing their biological functions.Meanwhile,the derivation analysis is an efficient approach for the qualitative and quantitative detection of carbohydrates with high sensitivity.This paper reviewed a derivative method using 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) as reagent,which is mild,sensitive and highly selective,and is widely used in the analysis of monosaccharide composition,degree of polymerization，degree of substitute,disaccharides isomers ,as well as relative quantitation and structural identification of O-and N-glycans.

1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP);derivative approach;carbohydrate analysis；review

2015-08-26；

2015-09-25

国家基金委山东联合基金(U1406402)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2013BAB01B02)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.020

O629.1；G353.11

A

1004-4957(2016)03-0367-06

*通讯作者：赵 峡，博士，教授，研究方向：糖类分析，Tel:0532-82031560，E-mail:zhaoxia@ouc.edu.cn