固相萃取/18O标记高氯酸根稀释高效液相色谱-串联质谱法测定水果中的高氯酸盐

吴映璇,林 峰,姚仰勋，卲琳智，欧阳少伦

(1.广东出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，广东 广州 510623；2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623)



固相萃取/18O标记高氯酸根稀释高效液相色谱-串联质谱法测定水果中的高氯酸盐

吴映璇1,2*,林 峰1,2,姚仰勋1,2，卲琳智1,2，欧阳少伦1,2

(1.广东出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，广东 广州 510623；2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623)

建立了水果中高氯酸盐的高效液相色谱-串联质谱分析检测方法。样品采用1%乙酸提取，C18固相萃取柱净化，Waters IC-Pak Anion HR(4.6 mm× 75 mm)色谱柱洗脱,流动相为乙腈-100 mmol/L 乙酸铵溶液(体积比 60∶40),流速 0.7 mL/min；液相色谱-三重四极杆质谱联用技术-电喷雾负离子监测模式检测，采用18O标记高氯酸根离子作为内标进行基质校正，内标法定量。结果表明：高氯酸盐在0.1～10.0 μg/L范围内线性关系良好，定量下限为1.0 μg/kg；在1.0，2.0，10 μg/kg 3个加标水平下的回收率为92.5%～110%，相对标准偏差(RSD)为1.4%～5.4%。实际样品检测表明该方法准确可靠，适合于水果中高氯酸盐的测定。

高氯酸盐；18O标记高氯酸根离子稀释;固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；水果

水果是日常生活中不可或缺的食物之一，不但营养丰富，更有降血压、减缓衰老、明目、抗癌、降低胆固醇等保健作用。其富含的维生素是婴幼儿成长发育不可缺少的营养元素，富含的叶酸有助于细胞繁殖与修复，能帮助胚胎神经系统良好发育，预防孕妇贫血。由于水果对婴幼儿和孕妇的健康具有潜在的影响,其安全问题显得非常重要。高氯酸盐是指含有高氯酸根离子([ClO4]-)的盐类，其物理化学性质极其稳定，水溶性高，流动性强，具有高度的扩散性和持久性，可经土壤、水等途径被植物吸收富集，并通过食物链进入人体[1]。高氯酸盐进入人体后主要通过与碘离子竞争性结合利用钠/碘转运体(NIS)载运膜蛋白，抑制甲状腺对碘离子的吸收，导致甲状腺功能紊乱，干扰T3和T4激素的合成与分泌，从而引发下丘脑-垂体-甲状腺轴系列的补偿机制，最终影响人体正常新陈代谢和生长发育，孕妇严重的甲状腺功能不足会导致胎儿的呆小症[2-3]。

目前，国外已有关于饮用水、水源、奶类、蔬菜以及营养补充剂等中高氯酸盐含量的相关调查研究[4-5]，检测含量为0.89～768 μg/kg；我国也有关于饮用水、牛奶和奶粉等中的高氯酸盐污染情况研究[6-8]，检测含量为0.05～464 μg/kg。尚未发现有关水果中高氯酸盐含量的测定研究。因此，建立快速准确测定水果中高氯酸盐含量的分析方法，保障人群尤其是孕妇和婴幼儿等敏感群体的健康，已迫在眉睫。

高氯酸盐的测定方法主要有离子色谱法[5,9]、表面增强拉曼散射法[10-11]、离子色谱-质谱联用技术[3-5,8-9,12-16]和高效液相色谱-质谱/质谱法[6-7]等。虽然离子色谱法可测定高氯酸根离子,但其检测器缺乏选择性,且易出现假阳性。表面增强拉曼散射法的重现性较差，定量分析困难。离子色谱-质谱法能够满足检测需求，但该设备的普及率不高，不利于方法的推广和应用；相比之下，高效液相色谱-质谱法具有良好的灵敏度和选择性，且设备普及更广，利于推广应用。本课题组在已有研究基础上采用液相色谱-串联四极杆质谱结合18O标记高氯酸根稀释、固相萃取等技术，建立了水果中高氯酸盐的检测方法。解决了由于电喷雾离子源造成的电离抑制现象，从而避免了对高氯酸盐测定的影响并避免了结果偏差[17]。该方法准确、快速、灵敏，能够为水果中高氯酸盐污染状况的监测和产品质量控制提供科学依据和技术支持。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

高氯酸盐标准溶液，Inorganic Ventures(CAS No：7601-89-0，纯度：100%，浓度1 000 mg/L)；18O标记高氯酸根溶液(纯度：90%，浓度100 μg/mL，Cambridge Isotope Laboratories);乙腈(HPLC级，美国Tedia公司)；乙酸(HPLC级，德国 Merck Darmstadt 公司)；乙酸铵(优级纯，印度 Fluka 公司)。莲雾、苹果、橙子和橘子在果蔬市场购买后，于4 ℃冰箱保存备用。

4000QTRAP液相色谱-串联质谱仪(美国 AB Sciex公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；旋涡振荡器(德国IKA公司)；C18固相萃取柱(200 mg/3 mL，美国Waters公司),经3 mL乙腈、3 mL 1%乙酸活化后备用；离心机(德国 Sigma 公司)。聚丙烯离心管：50 mL和1.5 mL。实验所用的试剂和标准溶液存储容器均需先用30%硝酸溶液预处理。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的制备 标准储备溶液(10 mg/L)：准确吸取适量高氯酸盐标准溶液，置于100 mL容量瓶中，用水定容，于4 ℃保存。18O标记高氯酸根储备溶液(10 mg/L)：准确吸取适量的18O标记高氯酸根标准溶液，置于10 mL容量瓶中，用水定容，于4 ℃保存。标准工作溶液：吸取一定量的标准使用溶液和18O标记高氯酸根使用溶液，用水配制成系列浓度的标准工作溶液，浓度在0～10 μg/L范围内，18O标记高氯酸根浓度均为2.0 ng/mL，当天配制。

1.2.2 溶液的配制 1%乙酸溶液：移取 10.0 mL乙酸至 1 L容量瓶中，加水至刻度，摇匀备用；乙酸铵溶液(100 mmol/L)：称取7.708 g乙酸铵，用水溶解定容至1 000 mL，混匀后备用。

1.2.3 样品提取 称取试样5 g(精确至0.01 g)至50 mL离心管中，加100 μL18O标记高氯酸根中间溶液(100 μg/L)和25.0 mL 1%乙酸溶液，涡旋振荡2 min，10 000 r/min离心10 min，分离上清液于具塞离心管中，用1%乙酸溶液定容至25 mL刻度，摇匀，待净化。

1.2.4 样品净化 吸取1.5 mL上清液过固相萃取C18柱，收集流出液，涡旋振荡30 s，转移至1.5 mL离心管，10 000 r/min离心10 min，吸取上清液，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

1.2.5 液相色谱-质谱/质谱条件 色谱条件：IC-PakTMAnion HR柱(6 μm，4.6 mm×75 mm)；流动相：乙腈-100 mmol/L乙酸铵溶液(60∶40)，等度洗脱。流速：0.70 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。质谱条件：电喷雾负离子模式(ESI-)扫描；多反应监测方式检测；气帘气压力(CUR)：207 kPa；雾化气压力(GS1)：414 kPa；辅助加热气压力(GS2)：483 kPa；碰撞气压力(CAD)：HIGH；电喷雾电压(IS)：-1 000 V；离子源温度(TEM)：550 ℃;监测离子对、碰撞能量、去簇电压、采集时间和保留时间见表1。

表1 高氯酸盐的质谱分析参数

Table 1 LC-MS/MS parameters for perchlorate analysis

CompoundRetentiontime(min)Parention(m/z)Daughterion(m/z)Declusteringpotential(V)Collisionenergy(V)Perchlorate46199，10183∗，85-44，-65-36，-37Isotopelabelledperchlorate46110789-80-37

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂种类及体积的选择

已有文献中采用水[4,6,9]或1%乙酸溶液[5,7-8]为提取溶剂，鉴于高氯酸盐的高溶解性质，本实验分别采用1%乙酸溶液和水作为提取溶剂，以莲雾为例进行研究，比较高氯酸盐在溶剂(水和1%乙酸)和样品(莲雾)中的提取效率。实验结果显示，1%乙酸溶液的提取效果优于水。同时，由于1%乙酸溶液对目标化合物的溶解度大，对杂质的溶解度小，且与目标化合物不起化学变化；经济、易得、使用安全。因此，本实验选用1%乙酸溶液作为提取溶剂。

进一步考察了相同量的试样加入不同体积(5，10，25，30 mL)1%乙酸溶液对提取效率的影响，发现均存在基质抑制情况，但在添加同位素内标后，不同体积1%乙酸溶液的提取效率无明显区别，回收率在98.6%～103%之间。考虑到基质效应与后续净化等因素，本实验选择1%乙酸的体积为25 mL。

2.2 固相萃取柱的选择

对比了常用的C18固相萃取柱、Oasis HLB固相萃取柱和石墨碳黑柱的净化效果。结果表明，C18固相萃取柱的回收实验较理想，色素等杂质保留在固相萃取柱上，而高氯酸盐及18O标记高氯酸根离子则没有保留，随流出液流出；Oasis HLB固相萃取柱和石墨碳黑柱对高氯酸盐没有保留，但对18O标记高氯酸根离子有很强的吸附作用，难以将其洗脱，因此本实验选用C18固相萃取柱。

2.3 滤膜的吸附作用研究

在液相色谱分析中，为避免管路堵塞，根据筛分原理，通常使用滤膜对待测样液进行过滤。对实验室常用的两种滤膜(尼龙66和聚醚砜滤膜)分别进行测试。结果发现，这两种滤膜对高氯酸盐及其同位素内标均有不同程度的吸附，其中尼龙66滤膜对高氯酸盐及其同位素内标的吸附达90.5%和95.8%；聚醚砜滤膜对高氯酸盐及其同位素内标的吸附分别为62.4%和63.4%。本实验采用高速离心的方式将待测样液中可能存在的大颗粒物质去除，避免了使用滤膜后对待测样液的吸附作用,以取得较好的回收率。

2.4 质谱条件的优化

用蠕动泵以10 μL/min的流速分别连续注射0.5 mg/L的高氯酸盐和18O标记高氯酸根标准溶液于ESI离子源中，由于高氯酸盐中的氯离子在自然界存在同位素35Cl和37Cl，负离子检测方式下对高氯酸盐进行一级质谱分析(Q1扫描)，得到高氯酸盐的准分子离子峰(m/z99，101)和18O标记高氯酸根的准分子离子峰(m/z107，109)。对准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息,选择响应值高、基线噪音低的离子对m/z99/83,101/85作为监测离子对(定性离子对)，选择信号最强的m/z99/83作为定量离子对，选择响应值高的m/z107/89作为18O标记高氯酸根的特征离子对。采用MRM模式采集数据，各离子对的优化质谱参数见表1。

2.5 线性范围、检出限与定量下限

在优化条件下，取一系列不同浓度的高氯酸盐标准溶液，其中18O标记的高氯酸标准溶液浓度为2 μg/L，以高氯酸盐质量浓度(X，μg/L)对高氯酸盐与18O标记高氯酸根定量离子的峰面积比值(Y)进行线性回归。结果表明，高氯酸盐的浓度在0.1～10.0 μg/L范围内线性关系良好，回归方程为y=0.454x+0.011 1,相关系数(r)为0.999 9。按照3倍信噪比计算，高氯酸盐在莲雾和苹果中的检出限(LOD)分别为0.01 μg/kg和0.015 μg/kg；莲雾和苹果样品中添加水平为1.0 μg/kg时，信噪比均大于10，表明其定量下限(LOQ)可达到1.0 μg/kg。当样品中高氯酸盐的浓度超过线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。

2.6 加标回收率与相对标准偏差

采用含有低含量高氯酸盐的莲雾样品(0.10 μg/kg)和苹果样品(0.24 μg/kg)进行加标回收和精密度实验，加标水平为1.0，2.0，10.0 μg/kg，按照本方法进行提取和净化，每个加标水平平行测定10次。结果表明，莲雾样品中高氯酸盐的平均回收率为92.9%～110%，相对标准偏差(RSD)为1.4%～5.2%；苹果样品的平均回收率为92.5%～108%,RSD为4.2%～5.4%。采用建立的方法检测市售莲雾、苹果、橙子和橘子共10个水果样品，其中橘子中高氯酸盐含量为1.65 μg/kg，其他9个水果样品均低于1.0 μg/kg。

3 结 论

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Determination of Perchlorate in Fruits by Solid Phase Extraction/18O Labeled Perchlorate Dilution High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Ying-xuan1,2*,LIN Feng1,2,YAO Yang-xun1,2,SHAO Lin-zhi1,2,OUYANG Shao-lun1,2

(1.Inspection and Quarantine Technology Center in Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China;2.Key Laboratory of Animals and Plants and Food Import and Export of Technical Measures in Guangdong Province,Guangzhou 510623,China)

An analytical method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS) was developed for the determination of perchlorate in fruits.Samples were extracted with 1% acetic acid.The extract was cleaned up on an C18solid-phase extraction(SPE) cartridge,and separated on a Waters IC-Pak Anion HR column(4.6 mm×75 mm) using acetonitrile -100 mmol/L ammonium acetate(60∶40) as mobile phase at a rate of 0.7 mL/min.The detection of perchlorate anion was performed by high performance liquid chromatography triple stage quadrupole mass spectrometry,equipped with electrospray ionization(ESI) in the negative ion mode.An18O-labelled perchlorate anion internal standard was used to correct matrix effects.Quantification analysis was conducted by the internal standard calibration.Good linearity was observed for perchlorate in the concentration range of 0.1- 10.0 μg/L.The limit of quantitation was 1.0 μg/kg.The recoveries of perchlorate in different samples at three spiked levels of 1.0,2.0,10.0 μg/kg were in the range of 92.5%-110%,with relative standard deviations of 1.4%-5.4%.The real sample analysis showed that this method was accurate and could be applied in the determination of perchlorate in fruits.

perchlorate；18O-labelled perchlorate dilution;solid-phase extraction;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；fruits

2015-06-18；

2015-09-01

检验检疫行业标准计划项目(2009B535)；广东检验检疫局科技计划项目(2015GDK10)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.018

O657.63;O623.422

A

1004-4957(2016)03-0355-04

*通讯作者：吴映璇，硕士，高级工程师，研究方向：食品安全检测，Tel：020-38290337，E-mail: allanwyx@126.com