斜投影和空间夹角判据结合紫外光谱分析滴眼液中苯扎氯铵

杨向妮，姚志湘*，粟 晖，刘 柳

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006)



斜投影和空间夹角判据结合紫外光谱分析滴眼液中苯扎氯铵

杨向妮1,2，姚志湘1,2*，粟 晖1,2，刘 柳1,2

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006)

采用紫外光谱，将斜投影(OP)与空间夹角判据(SAC)相结合，通过十二烷基二甲基苄基氯化铵(1227)含量反映苯扎氯铵(BAC)含量的方式建立了一种快速检测滴眼液中BAC的新方法。首先采用斜投影提取BAC混合物中1227的纯信号，以提取的光谱信号与对应浓度值进行最小二乘拟合，建立标准光谱矩阵；再通过高效液相色谱-紫外光谱联用获取滴眼液本底光谱矩阵；最后根据空间夹角判据测定滴眼液样品中1227的含量，并以此反映BAC的含量。结果显示：在1～20 μg/mL浓度范围内，斜投影提取的1227纯信号与对应浓度呈良好线性关系(r>0.999 6)，方法的检测结果与高效液相色谱法接近，相对误差不大于2.3%，相对标准偏差(RSD，n=6)不大于2.8%，回收率为99.6%～101.8%。该方法采用多波长紫外光谱直接定量BAC，无需复杂的样品前处理，定量时间短，分析效率高，稳健性好，可推广应用于其他领域。

斜投影；空间夹角判据；高效液相色谱-紫外光谱联用；苯扎氯铵；滴眼液

苯扎氯铵(BAC)是滴眼液中一种常用的防腐剂，使用添加过量BAC的滴眼液会对眼内细胞造成伤害[1]，即使其浓度低于0.001%，经常使用或使用超过30 min以上也会引起角膜上皮细胞功能障碍[2]。

目前BAC的检测方法主要为高效液相色谱(HPLC)法[3-6]，HPLC能有效测定BAC含量，但其色谱峰易拖尾，柱效难以满足需求，分析时间长，溶剂消耗量大且需使用有毒溶剂；质谱分析法[7]所用仪器昂贵、普及度小，且会破坏分析样品。此外气相色谱法[8]、紫外分光光度法[9]、薄层色谱法[10]、毛细管电泳法[11-12]、伏安法[13]等方法在分析要求较高的情况下均受到一定限制。近年来，化学计量学方法的快速发展给复杂样品分析带来新的生机，空间夹角判据(Space angle criterion,SAC)作为一种新的化学计量学方法，因具有所用样品数量少、预处理简单、方法简便、快速等优点得到较多应用。粟晖等[14]采用该方法成功分析了化妆品中对羟基苯甲酸酯的含量。然而，BAC是由3种正烷基取代基(C12，C14，C16)二甲基苄基氯化铵同系物组成的混合物，该方法不适用于分析物为混合物，无法得到目标组分纯物质信号的情况，并且直接用BAC定量常会因对照品与滴眼液产品中同系物组成不一致而对分析造成困扰。

因此，为克服此困扰、拓展空间夹角判据方法的普适性，本文提出用同系物十二烷基二甲基苄基氯化铵(1227)的含量反映BAC含量进行样品中BAC的含量检测，以斜投影(Oblique projection,OP)与空间夹角判据相结合的方式来改善方法局限性，首先采用斜投影[15]将感兴趣组分(1227)纯物质信号从BAC混合物中提取出，再结合空间夹角判据定量滴眼液中1227，并以此反映BAC的含量。据此建立了一种快速检测滴眼液中BAC含量的新方法。

1 方法原理及分析步骤

复杂化学体系(多变量体系)可由多个互不平行向量组成的空间(Mb)确定描述，每个向量代表体系中一个独立的化学组分。斜投影系将Mb看成由“感兴趣组分”向量(S)与除S外的其他组分构成的相邻子空间(H)所组成。根据空间中的线性变换关系，空间中存在投影变换，S与H互为核关系，其核关系建立的模型通过系列正交投影来实现，可描述S、H的非正交关系。其投影变换表达式为式(1)，其中ES|H称为斜投影算子，PH为沿着子空间H到子空间S的投影算子，I为与PH维数相同的单位矩阵。通过计算ES|H建立模型，可将“感兴趣组分”向量S从复杂体系y中以数学的方式分离提取出，即S=ES|H*y。

ES|H=S(STPH┴S)-1STPH┴,PH┴=I-PH=I-H(HTH)-1HT

(1)

空间夹角判据也将每一种化学纯组分看作一个向量，复杂化学体系即是由多个向量构成的空间。向量与空间存在夹角，当“感兴趣组分”向量V在数据空间Ms中时，夹角为0，当“感兴趣组分”向量V不在数据空间Ms中时，V与Ms存在固定夹角。由此作为判据，通过逐步扣减分析样中V向量分析复杂体系中“感兴趣组分”的含量值。详见文献[16]。

具体实施步骤如图1所示。

图1 方法流程图Fig.1 Operating steps of the method

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(LC-20AT，岛津公司)，紫外-可见分光光谱仪(Maya2000Pro，Ocean Optics)，电子分析天平(AR124CN，奥豪斯仪器有限公司)。乙腈(HPLC级)，冰乙酸、乙酸铵、三乙胺、甲醇(分析纯)，苯扎氯铵(按C22H40ClN计,每1 mL含苯扎氯铵12.02 mg，含n-C12H25取代基同系物65.49%，n-C14H29取代基同系物34.09%)(HPLC级)，滴眼液7种(市售)。

2.2 实验条件

高效液相色谱条件：色谱柱：ODS-SP92689 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；等度洗脱,流动相为0.02 mol/L醋酸铵(每升中含三乙胺10 mL，用冰醋酸调节pH值至5.0±0.5)-乙腈(10∶90)；流速：1 mL/min；检测波长：262 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。

紫外光谱仪条件：波长范围196.93～400.36 nm，光谱间隔0.46 nm，石英比色皿光程为1.0 cm，以二次蒸馏水为参比样品，积分时间设为8 ms。

2.3 BAC标准品、滴眼液样品的制备及数据获取

精确移取0.5 mL 12.02 mg/mL的BAC(C12取代基65.49%，C14取代基34.09%。按C12计，为7 871.898 μg/mL)标准品于100 mL容量瓶中，以二次蒸馏水定容，得浓度为39.359 μg/mL的标准母液，并以二次蒸馏水配制浓度为1～20 μg/mL的标准溶液，取其紫外光谱数据，记为y。

根据市售7种滴眼液样品特点用二次水对样品进行不同倍数的稀释，分别记为1﹟～7﹟样品，另取与其中1种滴眼液同品牌不同批号的样品同法稀释，记为8#样品，采集各样品的紫外光谱，记为a。

将液相色谱仪与紫外光谱仪联接，设置好仪器参数后获取不同浓度BAC标准溶液、各滴眼液样品的时间、波长、光强度三维数据Mb、Ms。

以高效液相色谱法为对比方法，取不同浓度BAC标准溶液进行液相色谱分析，以1227的峰面积(A)为定量标准绘制标准曲线；8份滴眼液样品不经稀释过滤后直接进样，取其与1227出峰时间一致时的峰面积，按外标法计算含量。

2.4 回收率与精密度实验

选取1#，2#，3#样品进行方法准确度验证，取3份1#样品加入浓度为6，8，10 μg/mL的BAC标准溶液，取2#和3#样品各3份分别加入浓度为8，10，15 μg/mL的BAC标准溶液，采集其紫外光谱数据；选取1#和3#样品分别重复采集其紫外光谱6次，计算方法的精密度。

图2 1﹟样品的三维谱图Fig.2 Three-dimensional spectra of sample 1﹟

图3 BAC标准溶液的液相色谱图Fig.3 Chromatogram of BAC standard solution

3 结果与讨论

3.1 BAC及滴眼液的本底矩阵建立

将获得的BAC标准溶液、各滴眼液样品的三维数据Mb、Ms导入Matlab计算平台，并将光强度信号转化为吸光度(如图2)。于波长262 nm处绘制BAC的色谱图，找出1227的色谱出峰时间段，查阅相关文献并经过实验验证1227的出峰时间段在8.31～9.02 min(如图3)。扣除此段数据后，将其余部分加和作为BAC的本底数据矩阵H。同法获取滴眼液样品的本底数据矩阵H1，其中8﹟样品不参与建立本底。根据二阶差分值序列的折点[17]判断H、H1的主成分数N、N1，分别应用奇异值分解[USV]=svd[H]对光谱数据H、H1进行重构，选取U中前N、N1列加和作为降维后的本底光谱数据H′、H1′。

3.2 采用斜投影方法提取纯1227光谱建立标准光谱矩阵

选取 BAC标准溶液中1227液相色谱出峰响应值最高时间点8.38 min(如图3)的全波长光谱信号作为纯1227数据矩阵S。将不同浓度BAC的紫外光谱y、BAC的本底数据矩阵H′及S代入编写的斜投影程序，计算得到纯1227在不同浓度的全波长光谱数据；将其与对应的系列浓度进行最小二乘拟合得到标准光谱矩阵v，矩阵v由拟合系数列与残差列组成。其拟合结果显示：在1～20 μg/mL浓度范围内，斜投影提取的1227纯信号与对应浓度呈良好的线性关系(r>0.999 6)，表明通过斜投影方法可以准确提取混合物中单一物质的光谱信号。

3.3 采用空间夹角判据计算滴眼液中1227含量

将任一线性范围内的浓度值x1代入公式yi=aix+bi，得到此浓度下纯1227的光谱向量V；将滴眼液样品光谱a、滴眼液样品本底数据矩阵H′1及V代入编写的向量扣减程序，计算滴眼液样品中1227浓度(1227浓度值反映BAC浓度值)，并以高效液相色谱法为对比方法计算滴眼液中1227的浓度,两种方法的计算见表1。

表1 不同样本中1227的浓度及相对误差分析

Table 1 Concentration and relative error of benzalkonium chloride in different samples

SampleResultofobliqueprojectionwithspaceanglecriterionmethod(μg/mL)ResultofHPLC(μg/mL)Relativeerror(%)1﹟8548520232﹟00-∗3﹟102910260294﹟00-5﹟00-6﹟339347237﹟2422430418﹟796795013

*no detected

经比较，两种方法的测定结果接近，其相对误差不大于2.3%。其中2#,4#,5#样品中不含苯扎氯铵，两种方法的1227计算结果均为0，说明方法能准确预测待测组分浓度。由8#样品的比较结果可以看出，对于不参与建立本底的滴眼液样品，方法计算结果同样准确。此外，本方法采用多波长紫外光谱直接定量苯扎氯铵，操作简单，无需复杂的样品前处理过程，经建库后无需花费大量时间进行液相色谱分析，分析时间大大缩短，分析效率得到较大提高;通过软件方法实现光谱信号提取以及定量分析，降低了分析成本、仪器及试剂损耗；对于背景干扰严重的复杂体系，方法仍能准确预测，抗干扰能力强，可辨识程度高，稳健性好。

3.4 回收率与精密度

按照“3.3”所述步骤计算BAC在1#,2#,3#样品中的添加量，并与实际添加量进行比较，进一步验证方法准确度，结果如表2所示。结果表明：斜投影结合空间夹角判据的测定结果与实际添加量接近，方法可以准确计算BAC的添加量，回收率为99.6%～101.8%。1#和3#样品重复测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为2.8%和0.54%，表明方法具有较好的精密度。

表2 回收率实验结果

Table 2 Experimental results of recovery

SampleConcentrationof1227(μg/mL)Added(μg/mL)Resultofobliqueprojectionwithspaceanglecriterionmethod(μg/mL)Recovery(%)1#8526，8，101463，1661，18481018，1011，9962#08，10，15799，1001，1504999，1001，10033#10268，10，151825，2025，2525999，999，999

4 结 论

方法以十二烷基二甲基苄基氯化铵(1227)代替苯扎氯铵进行含量测定，不仅简化了计算，并可避免由于对照品与滴眼液产品中同系物组成不一致而使得分析结果不准确甚至无法分析的窘境。采用斜投影与空间夹角判据相结合打破了空间夹角判据的局限，拓展了方法的普适性，即使得不到待测组分的纯物质也可对其进行准确定量分析。斜投影纯信号分析方法可有效提取混合物中1227纯光谱数据，提取的1227光谱与对应浓度间呈良好的线性关系(r>0.999 6)。采用斜投影结合子空间-向量扣减的方法可以准确测定滴眼液中1227的含量，与液相色谱测定结果比较，相对误差不大于2.3%。本方法分析速度快，准确可靠，操作简单，节约分析成本和分析时间，使用样本数量少且样品无需复杂的前处理，为滴眼液中防腐剂的含量测定提供了一种有效检测手段，可推广应用于其他领域。

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Rapid Determination of Benzalkonium Chloride in Eye Drops with Ultraviolet Spectrum Based on Oblique Projection and Space Angle Criterion

YANG Xiang-ni1,2,YAO Zhi-xiang1,2*,SU Hui1,2,LIU Liu1,2

(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006, China;2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources,Liuzhou 545006,China)

A rapid new method for the determination of benzalkonium chloride (BAC) in eye drops complex system was developed with ultraviolet spectrum based on oblique projection (OP) and space angle criterion (SAC),in which the content of BAC is based on content of dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride (1227) .By treatment with oblique projection,the pure spectrum of dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride was obtained.The standard spectral matrix was set up by the least squares fitting the spectrum with the corresponding concentration.And then the background spectral matrix was obtained by using high performance liquid chromatography-ultraviolet spectrum(HPLC-UV).After that the contents of 1227 in different kinds of eye drops were calculated by using space angle criterion,and the content of BAC was obtained.The results indicated that the method exhibited a good linearity (r>0.999 6) for BAC in the range of 1-20 μg/mL.The determination results of this method is close to that of HPLC method,and the relative error is not more than 2.3%.The recoveries were obtained between 99.6% and 101.8%,with RSDs not more than 2.8%.The content of BAC could be directly obtained with multiple wavelength ultraviolet spectrum without complicated sample preparation,and the method has the advantages of short quantitative time,high analysis efficiency,good robustness,and could provide a feasible scheme for the detection of analyte of interest in other complex system.Key words：oblique projection;space angle criterion;high performance liquid chromatography-ultraviolet spectrum(HPLC-UV);benzalkonium chloride;eye drops

2015-08-21；

2015-09-17

广西科技计划项目(桂科攻1355010-15)；柳州市科技计划项目(2015J030201)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.014

O657.3;S482.294

A

1004-4957(2016)03-0337-05

*通讯作者：姚志湘，博士，教授，研究方向：过程分析技术，Tel：0772-2686670，E-mail：zxyao@gxut.edu.cn