藓类植物扫描电镜观察材料的制备

刘永英， 权玉萍， 李 琳， 赵建成

(1. 焦作高等师范专科学校 生物系，河南 焦作 454001；2. 河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024)



藓类植物扫描电镜观察材料的制备

刘永英1, 2， 权玉萍1， 李 琳2， 赵建成2

(1. 焦作高等师范专科学校 生物系，河南 焦作 454001；2. 河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024)

分拣、清洗并剥离厚肋流苏藓(Crossidiumcrassinerve)叶片数十片，放入2.5%戊二醛溶液中固定3 h，经磷酸缓冲液漂洗后，使用梯度浓度酒精逐级脱水(50%、70%、80%、90%各5 min，100%共3次，分别为5、10和20 min)，随后依次移入乙醇和乙酸异戊酯(1∶1)混合溶液以及乙酸异戊酯中分别置换15和20 min(或过夜)，经临界点干燥2 h后将叶片(腹面朝上)贴到金属台上喷金镀膜，最后用扫描电子显微镜观察、拍照。对照实验是叶片经自然风干后直接装台观察。经该实验临界点干燥法处理的藓类材料细胞结构完整、形态饱满、表面光滑，丝体末端细胞的疣形态和数目清晰可辨，观察效果理想。未经临界点干燥处理的样品丝体细胞和疣极度皱缩、塌陷，无法辨别细胞界限，疣的形态和数目更是无从知晓。该方法适用于藓类各器官的扫描电镜观察材料制备。

临界点干燥； 藓类； 扫描电镜

0 引 言

藓类植物微形态学特征常常是分类的重要依据，如蒴齿表面疣的有无、疣的分布形式、疣的形态，孢子表面纹饰，叶细胞表面疣的有无、疣的数目、疣的形态，芽胞结构，假根上疣的有无以及叶中肋上丝体或栉片等特殊附属结构，这些特征在分类群(如科、属和种等)间区分度明显，且在分类群内稳定。由于其形态微小，扫描电镜就成为重要的观察工具。用扫描电镜观察的生物样品必须经过干燥和导电处理，但在这一过程中常因急剧缩水致使样品变形。对于藓类植物的蒴齿结构及孢子等观察样品的处理相对简单，因为这些结构细胞壁厚，表面较为坚硬，自然风干即可[1-7]。但藓类植物的叶、假根和芽胞等含水量较高的幼嫩器官经自然风干后，细胞易出现收缩、塌陷等变形，致使这些重要结构严重失真[8]。临界点干燥法可避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构[9]。因藓类植物细胞有细胞壁不同于动物组织的处理方法[10-11]；又因植物体形态微小，叶片由单层细胞组成，假根、丝体等由单列细胞组成，所以也区别于其他高等植物组织的处理方法[12]，但目前国内未见相关研究报道。本文以观察丛藓科厚肋流苏藓[Crossidiumcrassinerve(De Not.) Jur.]叶片中肋腹面丝体为例，探讨扫描电镜样品的制备技术，从而找出一种较理想的扫描电镜样品制备方法，为藓类植物其他样品的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

将采自陕西省神木县(中科院水利部水土保持研究所侵蚀与环境试验站)生物结皮中的厚肋流苏藓[Crossidiumcrassinerve(De Not.) Jur.]标本装入密封袋中低温下带回实验室，置于冰箱4 °C条件下保存。

1.2 方 法

(1) 分拣。在体视显微镜下从生物结皮中分拣出厚肋流苏藓，用清水冲洗沙粒等杂质，吸水纸吸干植物表面水分。在体视显微镜下从植株上剥离30～40片带丝体的完好叶片。

(2) 固定。将叶片放入盛有2.5%戊二醛溶液(0.2 mol/L磷酸缓冲液配制)[13]的青霉素小瓶中，密封小瓶，用注射器反复抽取气体使叶片下沉，以便叶片完全浸于固定液中，4°C条件下固定3 h。随后，用pH 7.2的0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次5 min。

(3) 脱水。使用梯度浓度酒精逐级脱水：50%、70%、80%、90%各5 min，100%共3次，分别为5、10和20 min。

(4) 置换。移入乙醇和乙酸异戊酯(1∶1)的混合溶液中15 min以及乙酸异戊酯中20 min，置换2次或过夜。抽取气体或适当摇动使材料充分接触液体。

(5) 临界点干燥。将厚肋流苏藓叶片倒入内面铺有滤纸的钢网篮中，用液化CO2在HITACHI HCP-2型临界点干燥仪中干燥2 h。

(6) 装台。在体式显微镜下，用小号毛刷将叶片移到贴有双面胶带的金属台上(着生丝体的叶腹面朝上)，经HITACHI E-1020型离子溅射仪喷金镀膜。

(7) 观察。用HITACHI S-4800型扫描电子显微镜观察拍照。

(8) 对照实验。分拣出10～20片带丝体的完好叶片自然风干，未经临界点干燥法处理的材料直接装台后观察。

2 结果与讨论

(1) 图1是经临界点干燥法制备的厚肋流苏藓叶片及叶腹面中肋上丝体扫描电镜照片。结果显示：叶片形态结构完整，与自然生活状态一致(见图1(a))；叶中肋腹面中上部着生分枝或不分枝的丝体，每个丝体由2～7个细胞组成，丝体末端细胞呈圆柱形至圆锥形，末端细胞顶部有2～4个疣(见图1(b))。丝体细胞结构完整、形态饱满、表面光滑，丝体末端细胞的疣形态和数目清晰可辨，观察效果理想，以此可区分该种与属内其他种。图2是未经临界点干燥处理的样品扫描电镜照片，可见丝体细胞和疣极度皱缩、塌陷，无法辨别细胞界限，疣的形态和数目更是无从知晓。该研究采用临界点干燥法可有效避免细胞壁较薄的藓类植物器官——丝体细胞表面张力的影响，从而较好地保存了样品的微形态结构。藓类植物叶片和芽胞等器官的细胞与丝体细胞结构特点类似，即均是含水分较高的薄壁细胞，作者利用该方法处理其他藓类植物也达到了理想的观察效果[14]。因此，该临界点干燥法适用于藓类各器官的扫描电镜观察材料制备。

图1 经临界点干燥的厚肋流苏藓叶片及腹面丝体扫描电镜照片

图2 未经临界点干燥的厚肋流苏藓叶片 腹面丝体扫描电镜照片

(2) 根据藓类植物细胞主要成分，在样品制备中选用了浓度为2.5 %戊二醛作为固定液，该固定液对多糖、糖蛋白、微管等有较好的固定作用，且不会使组织细胞固定后变脆[14]。固定时要使材料充分接触液体，否则，漂浮于固定液上面的材料，因细胞结构没有被“固定”，即使后续处理过程正常也无法避免细胞出现皱缩或塌陷现象。由于细胞壁对固定液的渗透有一定的阻碍作用，固定时间不可过短[15]，但藓类植物器官多为单层细胞(如叶、苞叶等)或单列细胞(如假根和丝体等)组成，易与固定液接触，固定时间也无需太长，经试验认为固定3 h为宜。

(3) 样品从乙酸异戊酯中移入钢网篮后，不可久置于空气中，否则会因乙酸异戊酯挥发，空气进入细胞，使随后进行的液态CO2临界点干燥失去意义，最终不可避免地造成样品发生形变。但样品中残留过多的乙酸异戊酯会使样品干燥后仍有残余，从而影响干燥效果。所以，以样品半干时放入临界点干燥仪为宜。

(4) 干燥后的样品较脆弱，转移时要“轻取轻放”，避免用镊子等硬物碰触，以防细胞破碎，影响观察效果，最好选用小号的软毛刷贴台。

3 结 语

本文实验中的临界点干燥法有效避免了表面张力的影响，较好地保存了藓类样品的微形态结构，该方法适用于藓类各器官的扫描电镜观察材料制备。清晰的微形态结构将为藓类植物分类提供重要依据，化解一些特殊类群分类中难以解决的问题。

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Sample Preparation for Scanning Electron Microscope in Moss

LIUYong-ying1, 2,QUANYu-ping1,LILin2,ZHAOJian-cheng2

(1.Department of Biology, Jiaozuo Teachers College, Jiaozuo 454001, China;2. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China)

The aim of the work is to find out an optimizing method of sample preparation for scanning electron microscope (SEM) in moss based on critical point drying. Dozens ofCrossidiumcrassinerveleaves were peeled away from the sorted and washed plants, firstly these leaves were fixed in 2.5% glutaraldehyde solution for 3 h, secondly they were dehydrated in increasing ethanol gradients, 50%, 70%, 80% and 90%, each step for 5 min, finally in 100% with three times, for 5 min, 10 min and 20 min, respectively. After being rinsed with phosphate buffer solution, thirdly they were displaced by ethanol and isoamyl acetate mixture solution (1∶1) and isoamyl acetate for 15 min and 20 min successively, or overnight, then by critical point drying for 2 h, they were stuck on the specimen stub and sputtered with a gold layer. Finally they were analyzed in an SEM. Untreated leaves were regarded as a control group. The filament cells of the moss have plump form, integrated structure and smooth surface, and the number and shape of papilla of filament end cells were very clear by the critical point drying. A control group of without the critical point drying showed that the filament cells shrank and collapsed seriously so that the boundary of the cells was invisible, and the shape and number of papillae were unclear. It can conclude that the critical point drying can avoid surface tension of moss cells, preserve the microstructure of the biological sample, and could be used to sample preparation for SEM for every organic of moss.

critical point drying; moss; scanning electron microscope(SEM)

2015-05-25

国家自然科学基金项目(31370237)；河南省高等学校重点科研项目(15B180007)；高等学校博士学科点专项科研基金项目(2013130312005)

刘永英(1969-)，女，河南淮阳人，博士，副教授，主要从事苔藓植物学研究。Tel.: 13639629754; E-mail: jzbotany@163.com

赵建成(1956-)，男，陕西周至人，教授，博士生导师，主要从事苔藓植物学研究。

Tel.: 0311-80787560; E-mail: zhaojiancheng@mail.hebtu.edu.cn

Q 94-3396；N 33

A

1006-7167(2016)02-0052-03