基于PEG胁迫表达谱发掘调控谷子干旱胁迫的泛素连接酶E3基因

宋敏，马芳芳，侯思宇，张雁明，刘龙龙，耿潞阳，江璇宇，李红英，韩渊怀,3,4*

(1.山西农业大学 农学院，山西太谷 030801； 2．特色杂粮种质资源发掘与育种改良山西省重点实验室,山西太谷 030801;3．山西农业大学 农业生物工程研究所，山西太谷 030801； 4．农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,山西 太原 030031)



基于PEG胁迫表达谱发掘调控谷子干旱胁迫的泛素连接酶E3基因

宋敏1,2，马芳芳1，侯思宇1,2，张雁明1，刘龙龙2，耿潞阳1，江璇宇1，李红英1,2，韩渊怀1,2,3,4*

(1.山西农业大学 农学院，山西太谷 030801； 2．特色杂粮种质资源发掘与育种改良山西省重点实验室,山西太谷 030801;3．山西农业大学 农业生物工程研究所，山西太谷 030801； 4．农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,山西 太原 030031)

[目的]探析谷子调控干旱胁迫的E3基因。[方法]本文基于二代测序技术获得勾勾母鸡咀(GG)和晋汾16(JF)在PEG胁迫下的转录表达谱数据，运用生物信息学检索筛选出11个干旱相关的E3基因，对其理化性质、功能域、启动子元件、表达模式以及与其它物种E3基因的系统进化分析。[结果]蛋白等电点介于4.78～8.88之间，功能域主要为ZF_UBR型、ZF_RING和U_BOX型三类，启动子序列包含干旱诱导响应元件MBS或脱落酸响应元件ABRE等,其中Si001665m和Si022170m与PUB22/23亲缘关系较近，Si029090m与PUB19亲缘关系较近。[结论]初步确定这些是调控谷子干旱胁迫的E3候选基因，可能受干旱或脱落酸诱导表达，这为进一步研究谷子干旱响应相关的泛素连接酶E3基因提供理论依据。

谷子；泛素连接酶E3；干旱胁迫；表达谱

谷子(Setariaitalica)，禾本科，狗尾草属，在我国已有7 000多年的栽培史[1]，广泛分布于我国北方干旱与半干旱地区，具有抗旱耐贫瘠特性，是一种适应性较广的小杂粮。干旱是影响作物生长发育的关键因素之一，因此发掘谷子抗旱相关基因对产量提高尤为重要。

泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)广泛参与细胞激素信号传导和环境胁迫应答，细胞中的蛋白质泛素化降解过程经历泛素(ubiquitin，Ub)、泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素连接酶(ubiquitin-ligating enzyme，E3)以及26S蛋白酶体等途径。其中泛素连接酶E3作为UPS中的关键蛋白酶体，其种类最多，通过依赖/不依赖ABA信号途径，泛素化修饰某些干旱调控相关因子，介导植物的干旱胁迫响应过程[2]。目前单亚基E3蛋白根据其结构域不同可分为：HECT型、RING型和U-box型三大类[3]。

近年来研究泛素连接酶E3参与调控植物干旱响应的报道越来越多。拟南芥中已鉴定出的典型的干旱响应相关的U-box型E3蛋白有AtPUB18 、AtPUB19、AtPUB22和AtPUB23[4]。植物中参与干旱胁迫应答的RING型E3种类较多，SDIR1[5]是拟南芥中典型的RING-Finger型E3，可促进ABA信号介导的气孔关闭途径，正调控植物干旱响应过程；AtAIRP1/AtAIRP2是拟南芥中鉴定的正调控干旱应答的C3HC4-RING finger型E3[6]；RHA2a/RHA2b是正调控拟南芥萌发期和苗期干旱胁迫响应的RING-H2型E3[7]； AtSAP5是拟南芥中克隆的A20/AN1-zinc finger型E3，通过依赖/不依赖ABA信号的交叉途径正调控干旱响应过程[8]；另外，AtDRIP1/ AtDRIP2是拟南芥中已鉴定的不依赖ABA信号途径负调控干旱应答的C3HC4-RING finger型E3[9]。

此外，在其它植物中，Lee等[10]发现辣椒的RING-Finger型泛素连接酶CaRma1H1基因在拟南芥中异源表达能显著增强植株耐旱性。Park等[11]鉴定辣椒C3HC4-RING finger型CaAIR1蛋白参与 ABA信号介导的气孔关闭途径，负调控植株干旱响应过程。

目前国内外对于谷子中泛素连接酶E3调控干旱响应的研究还没有报道。本文拟通过对抗旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF)进行PEG模拟干旱胁迫处理，分析泛素连接酶E3基因干旱表达谱差异，首次筛选出泛素连接酶E3家族中参与调控谷子干旱胁迫应答的关键E3基因，这为我们后续探索E3基因如何调控干旱信号网络的研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试实验品种为谷子抗旱品种‘勾勾母鸡咀(GG)’和敏感品种‘晋汾16(JF)’。该材料由中国农业科学院作物科学研究所(国家作物种质资源库)陆平研究员惠赠。

植物材料种植于山西农业大学生物工程研究所人工气候室，实验基质为营养土∶蛭石(3∶1)；昼夜光照时间设置为14 h/10 h，昼夜温度设置为28 ℃/23 ℃，相对湿度50%±5%，光强强度300 μmol·m-2·s-1。萌发至五叶一心期时胁迫实验组将上述植物材料转至20% PEG-6000水溶液(sigma，美国)中，处理0.5 h，而对照组转至蒸馏水中处理0.5 h。同时，实验组和对照组的两个品种分别选取三株长势相同的健康幼苗混合取材，生物学重复3次，液氮速冻，送华大基因进行数字基因表达谱测序。

1.2 方法

根据谷子基因组数据库中查询到的泛素连接酶基因名，精确匹配查询上述材料胁迫和未处理条件下数字基因表达谱数据库中的相同基因。同时从Phytozome v11.0网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)的谷子基因组数据库中提取该类基因的染色体位置信息、启动子序列(选取基因上游1 500 bp序列)、基因组序列(包含UTR区、外显子/内含子特征、CDS序列等信息)以及蛋白序列(氨基酸序列等信息)，同时在NCBI网站上比对查找公共数据库中匹配的谷子基因的核酸和蛋白登录号。

使用ExPASy网站(http://web.expasy.org/protparam/)对该类基因的氨基酸序列进行相对分子量、等电点和功能结构域分析；利用Gene Structure Display Serve(GSDS 2.0)软件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制该类基因的基因组结构；在线工具Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测该类基因的启动子相关元件并进行统计分析；采用MEGA 7.0软件对E3蛋白及其它物种蛋白进行系统进化分析。运用R语言绘制实验组和对照组中该类基因的TPM表达值热图。

2 结果与分析

2.1 谷子干旱响应相关的泛素连接酶E3基因家族成员鉴定

我们对两个品种中调控干旱胁迫相关的泛素连接酶E3基因家族成员进行统计分析(图1)，结果发现JF中有146个E3基因参与干旱响应，而GG中有145个E3基因参与干旱响应，其中JF和GG中共同拥有141个E3基因响应干旱应答，JF中特有的参与干旱响应的E3基因有5个，而GG中仅有4个。

图1 JF和GG中参与PEG胁迫的E3基因维恩图Fig.1 Venn diagram of E3 genes in JF and GG under PEG stress

其次，对照组(GG_W和JF_W)与实验组(GG_D和JF_D)中的141个E3基因的TPM(Transcripts Per Million)表达值进行差异统计(图2)，其中对照组中仅有2个E3基因在PEG处理前TPM表达值无差异，其基因编号分别是Si000011m和Si002998m；实验组GG_D和JF_D中有5个E3基因在PEG处理后TPM表达值无差异，其基因编号分别是Si000011m、Si029137m、Si020196m、Si024543m和Si036795m基因；通过比较对照组和实验组中这些无差异的基因，我们发现仅有基因编号Si000011m在GG和JF中PEG处理前后TPM表达值无差异。此外，品种JF在PEG处理前后，共有4个E3基因TPM表达值无差异，而品种GG在PEG处理前后，141个E3基因TPM表达值均存在差异。

图2 JF和GG中参与PEG胁迫的E3基因TPM值表达差异维恩图Fig.2 Venn diagram of E3 genes TPM expression difference in JF and GG under PEG stress

以Si000011m基因为参照基因，对PEG处理前后的GG和JF品种中共有的141个E3基因的TPM表达值进行标准化热图分析，根据E3基因的表达差异，可以将141个基因分为两大族(I族和II族)。其中I族的130个E3基因在PEG处理前后表达量存在差异且差异不明显，不属于谷子干旱胁迫的关键候选基因；而 II族(图3)的11个基因在PEG处理前后的表达量差异较显著，因此II族中的11个基因成员在不同谷子品种的干旱胁迫应答中发挥一定调控机制。其中IIa亚族包括Si000011m、Si029090m、Si006416m和Si009444m四个基因；IIb亚族包括Si001665m、Si017372m、Si007141m、Si006345m、Si034488m、Si000009m和Si022170m七个基因。

图3 JF和GG中泛素连接酶E3基因的TPM值表达谱分析Fig.3 The expression profile of ubiquitin ligase E3 genes in JF and GG

2.2 谷子泛素连接酶E3基本信息及结构分析

针对以上II族的11个表达差异明显的泛素连接酶E3基因，我们通过NCBI网站和Phytozome网站中谷子数据库对其基本信息进行分析，结果(如表1)显示：II族成员的蛋白质氨基酸数目只有Si000009m和Si000011m两个蛋白的氨基酸最多，其余蛋白氨基酸数目均在253～763之间，可见这些泛素连接酶蛋白序列间差异明显；蛋白质分子量除Si000009m和Si000011m两个蛋白在230.0 ku左右，其余均介于26.8～86.5之间；等电点介于4.78～8.88之间，可见它们发挥催化活性的最适pH值均不同。

表1 谷子E3基因的基本信息

使用GSDS网站对II族E3成员的基因组结构进行绘制，结果(图4)可以看出：II族成员的基因组结构存在较大差异：其中Si000009m和Si000011m基因具有相同的基因组序列，它们通过共同的pre-mRNA以不同的剪接方式加工形成；此外Si009444m和Si034488m的基因组结构也含有较多外显子，呈现出明显的断裂基因特征；其余各E3成员的基因组结构较为简单，仅含一个开放阅读框结构特征。

图4 谷子E3基因内含子外显子结构Fig.4 Intron-exon structures of E3 genes in foxtail millet

2.3 谷子泛素连接酶E3蛋白结构域特征及系统进化分析

基于prosite数据库对II族成员进行蛋白质功能位点检索，发现II族成员主要分为3类E3蛋白结构域(图5)：Si000009m和Si000011m基因的蛋白序列具有ZF_UBR型结构域；Si007141m基因的蛋白序列具有ZF_RING型结构域；其余成员基因的蛋白均属于U_BOX型结构域，其中Si009444m和Si034488m基因的蛋白序列中还含有蛋白激酶结构域，Si001665m、Si006345m和Si029090m基因的蛋白序列还含有ARM_REPEAT结构域，可见它们调控干旱响应功能的复杂性和多样性。

为进一步分析II族中的11个泛素连接酶E3基因的功能特征，采用MEGA 7.0 软件对II族E3成员与拟南芥及其他禾本科作物的39个E3蛋白构建进化树，使用NJ法进行3 000 次 Bootstrap 重复检测，结果如图6所示：分为3个大类(A、B和C)，其中A大类主要为U_BOX型E3蛋白，其中Si001665m和Si022170m蛋白与PUB22/23亲缘关系较近，Si029090m与PUB19亲缘关系较近；B大类主要为Zinc Finger结构的3个E3蛋白，其中Si000009m和Si000011m蛋白均具有ZF_UBR结构域，它们与PRT6蛋白亲缘关系较近，Si007141m为ZF_RING型E3蛋白；C大类的Si009444m和Si034488m蛋白不仅包含U_BOX结构域，而且还具有蛋白激酶的活性，且均与PUB33蛋白亲缘关系较近。

2.4 谷子泛素连接酶E3基因的启动子元件分析

使用植物启动子顺式作用元件预测软件Plant CARE，对II族E3基因成员启动子序列(基因上游1.5 kb序列)中涉及激素响应以及逆境胁迫相关的顺式作用元件统计分析，结果(图7)发现II族E3基因的启动子序列中主要包含：核心启动子元件(TATA-box)、一般启动子元件(CAAT-box)以及其它涉及激素/胁迫相关的响应元件，如干旱诱导响应元件(MBS)、脱落酸应答元件(ABRE或motif IIb)、茉莉酸甲酯响应元件(TGACG-motif或CGTCA-motif)、赤霉素响应元件(GARE-motif或TCA-element)、乙烯响应元件(ERE)、生长素响应元件(TGA-element)、伤害相关元件(WUN-motif)、逆境与防卫相关元件(TC-rich repeats)、厌氧诱导相关元件(GC-motif)、低温诱导响应元件(LTR)、热激响应元件(HSE)等。

其中Si000009m和Si000011m基因拥有相同的启动子序列，图7所示，大部分基因的启动子包含干旱诱导响应元件MBS如：Si001665m、Si006345m、Si006416m、Si009444m、Si017372m、Si022170m和Si029090m；包含脱落酸响应元件(ABRE或motif IIb)的基因有：Si000009m、Si000011m、Si001665m、Si009444m、Si029090m和Si034488m；包含逆境与防卫相关元件(TC-rich repeats)的基因有：Si000009m、Si000011m、Si001665m、Si006416m、Si007141m和Si029090m。

2.5 谷子泛素连接酶E3基因的表达分析

我们分别对II族成员E3基因的TPM表达值进行分析(图8)，结果表明：Si000009m和Si000011m基因对干旱的应答反应截然不同，Si000009m基因在GG和JF中的相对表达值均下调5倍左右，而Si000011m基因在GG和JF中却上调5倍；Si001665m和Si017372m基因在GG和JF这两个品种中表达情况恰好相反，均在抗旱品种GG中表达下调，但在干旱敏感品种JF中表达上调；Si006416m和Si029090m基因在GG和JF中表达均上调，但在GG中上调强度较大，在JF中上调强度较小；Si006345m、Si007141m、Si022170m以及Si034488m基因在GG和JF中表达均下调，而且品种间的表达量均存在明显差异；Si009444m基因在GG_D中较对照组GG_W中表达上调6.5倍，但在JF_D中表达量与对照组JF_W相比却无差异。

图5 谷子E3蛋白的功能结构域Fig.5 Functional domains of E3 proteins in foxtail millet

图6 谷子E3蛋白与其它植物(拟南芥、水稻、短花药野生稻、玉米、乌拉图小麦、高粱、短柄草)E3蛋白的系统进化分析Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree of E3 proteins in Si(Setariaitalica),At(Arabidopsis thaliana),Os(Oryza sativa), Ob(Oryza brachyantha), Zm(Zea mays),Tu(Triticum urartu),Sb(Sorghum bicolor),Bd(Brachypodium distachyum)

3 讨论

已有研究表明，泛素连接酶E3成员参与植物干旱胁迫响应[2]。然而谷子作为一种耐旱作物，其中是否有相关的泛素连接酶E3基因也参与干旱调控目前还没有相关报道。泛素连接酶E3蛋白是一类数量众多、类型多样化的大家族，在干旱信号网络传导方面，一般通过泛素化修饰降解某些干旱调控相关蛋白因子发挥关键调控机制，近些年国内外学者已报道的调控干旱响应的单亚基泛素连接酶E3均属于U-Box型或RING型[2]，另有学者发现多亚基泛素连接酶E3中的F-box元件也参与调控干旱应答，如Zhang等[12]鉴定拟南芥F-box蛋白元件DOR是干旱的负调控因子。本研究从GG和JF品种的PEG模拟干旱转录组数据中发掘出11个泛素连接酶E3基因，其中有8个属于U-Box型，2个属于UBR zinc finger型，1个属于ZF_RING型，这些调控干旱响应的E3蛋白结构域类型与前人的结论相似。这些结论为探索谷子中与干旱响应相关的泛素连接酶E3基因类型提供了重要的线索和依据。

系统进化树表明Si001665m和Si022170m蛋白与PUB22/23亲缘关系较近，现已研究表明在拟南芥中AtPUB22/ AtPUB23不依赖ABA信号途径，AtPUB22或AtPUB23的单基因突变株系比野生型表现出超强的耐旱性，而双基因突变株系又比单基因突变体株系表现出更强的耐旱性[4]；另外，Si001665m和Si022170m基因启动子序列中均包含干旱响应元件(MBS)，Si001665m基因启动子还存在ABA响应元件(ABRE)，而Si022170m并没有，可见Si001665m可能依赖ABA信号途径介导干旱应答，而Si022170m可能不依赖ABA信号途径介导干旱应答，这些结论与不依赖ABA信号途径的同源蛋白AtPUB22/23调控机制略有差异，这可能是不同物种间基因选择性进化的差异造成的。Si029090m蛋白与PUB19亲缘关系较近，研究表明在拟南芥中AtPUB18/19依赖于ABA信号途径，AtPUB18或AtPUB19的单双基因突变株系均对ABA极其敏感，能够通过调控ABA信号介导的气孔关闭途径增强植株的耐旱性，因此负调控植物对干旱的响应过程[4]；Si029090m基因启动子序列中含有脱落酸响应元件(ABRE)和干旱响应元件(MBS)，表明其也依赖ABA信号途径并且参与干旱胁迫应答。Si006416m蛋白与PUB21亲缘关系较近，拟南芥中AtPUB20和AtPUB21是一对高度的同源蛋白体，同属AtCMPG基因家族[13]对逆境防御和抗病有非常重要的调控作用；此外Si006416m基因启动子序列包含干旱诱导元件(MBS)及逆境与防卫相关元件(TC-rich repeats)等，可见其与干旱等逆境胁迫有关。Si000009m和Si000011m蛋白与PRT6亲缘关系较近，PRT6主要参与N-端规则途径，prt6等位基因突变体[14]对涝害和饥饿的耐受能力更强，因此Si000011m和Si000009m基因可能与植株根系浸泡PEG水溶液后的涝害胁迫有关。此外Si017372m与PUB25/26亲缘关系较近，Si006345m与PUB39亲缘关系较近，Si034488m蛋白和Si009444m蛋白与PUB33亲缘关系较近，但是这些基因目前与干旱胁迫的作用机理尚不清楚。这些结论为首次研究谷子中与干旱胁迫相关的泛素连接酶E3基因功能提供了一定的理论参考。

图7 谷子E3基因启动子顺式作用元件的相对分布图Fig.7 Relative distribution of cis-acting regulatory elements in foxtail millet E3 gene Promoters 注：本图中主要列举了TATA框、CAAT框以及与激素响应和逆境胁迫相关的顺式作用元件Note: TATA box, CAAT box, and cis acting elements associated with the hormone response and stress response are listed in this picture

图8 谷子E3基因在PEG干旱胁迫下的表达分析Fig.8 Expression analysis of E3 genes in foxtail millet under PEG stress 注：以PEG处理前后各基因的TPM表达量比值(GG_D/GG_W或JF_D/JF_W)的Log2值代表各基因的相对表达量Note: The Log2 value of the ratio (GG_D/GG_W or JF_D/JF_W)of TPM expression of each gene before and after PEG treatment represented the relative expression of each gene

本文通过对干旱敏感程度不同的两个谷子品种(GG和JF)进行PEG模拟干旱处理，其中GG属于抗旱品种，JF属于干旱敏感品种。干旱表达谱热图分析表明：共有11个E3基因在PEG模拟干旱处理前后的GG和JF中存在明显表达差异，其中Si000009m和Si000011m基因虽属于同一基因的不同剪接体，但Si000009m在GG和JF中相对表达量下调，而Si000011m在GG和JF中相对表达量上调，说明Si000009m和Si000011m基因可能在谷子干旱胁迫响应过程中存在相反的调控机理；Si001665m和Si017372m基因在GG中下调，而在JF中上调，可见这两个基因在干旱敏感程度差异较大的两个品种中，相对表达模式也相反，这可能也是造成GG或JF对干旱敏感程度存在差异的原因之一；Si006345m、Si007141m、Si022170m及Si034488m基因在GG和JF中表达量均下调，但下调程度差异较大，Si006416m、Si009444m和Si029090m基因在GG中比 JF上调较大，这些基因对干旱应答的表达模式虽然相同，但各基因在两品种间的表达量存在较大差异，这可能是由于不同干旱敏感程度谷子品种间的内在差异造成的。

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(编辑：武英耀)

Ubiquitin ligaseE3 genes mining based on expression profiles under PEG stress in foxtail millet

Song Min1,2, Ma Fangfang1, Hou Siyu1,2, Zhang Yanming1, Liu Longlong2, Geng Luyang1, Jiang Xuanyu1, Li Hongying1,2, Han Yuanhuai1,2,3,4*

(1.SchoolofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China, 2.ShanxiKeyLaboratoryofGeneticResourcesandBreedinginMinorCrops,Taigu030801,China, 3.InstituteofAgriculturalBioengineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China, 4.KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementonLoessPlateauofMinistryofAgriculture,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030031,China)

[Objective]Analysis ofE3 genes in foxtail millet under drought stress. [Methods]In this paper,Gou Gou Mu Ji Ju and Jin Fen 16 based on expression profiles under PEG stress using NGS technology,11 differentially expressed ubiquitin ligaseE3 genes were revealed.Through the prediction and analysis of physicochemical properties,functional domains,regulatory elements in promoters,expression difference,sequence alignment and phylogenetic analysis.[Results]We found that isoelectric point was between 4.78～8.88,functional domains mainly include ZF_UBR type,ZF_RING type, and U_BOX type.The promoters sequence contained MBS,ABRE,etc.Phylogenetic showed that Si001665m and Si022170m were closely related to PUB22/23,Si029090m were closely ralated to PUB19.[Conclusion]Some ubiquitin ligaseE3 genes, which may be induced by drought or ABA, were identified.This would provide a theoretical basis for further research of ubiquitin ligaseE3 in response to drought in foxtail millet.

Foxtail millet, Ubiquitin ligase E3, Drought stress, Expression profile

2016-10-10

2016-10-21

宋敏(1992-)，女(汉)，山西长治人，在读硕士，研究方向：植物基因工程

*通讯作者：韩渊怀，教授，博士生导师。Tel:0354-6286399; E-mail:swgctd@163.com

国家自然科学基金(31371693，31471556，31401396)

S515

A

1671-8151(2016)12-0860-08