谷子硒结合蛋白基因及其与抗旱性的关系

武彩娟，苏彦冰，程璐，王钇杰，元旭朝，高炜，李红英,2,3*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031； 3.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太谷030801)



谷子硒结合蛋白基因及其与抗旱性的关系

武彩娟1，苏彦冰1，程璐1，王钇杰1，元旭朝1，高炜1，李红英1,2,3*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031； 3.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太谷030801)

[目的]土壤与肥料中的硒元素进入植物体后，与植物中的蛋白质和活性有机成分结合成为植物有机硒，即植物硒结合蛋白。本研究以硒结合蛋白结构和功能为基础，探索其与谷子抗旱的关系。[方法]以谷子耐旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)为试材，以转录组中硒结合蛋白基因家族中10个基因为对象，利用生物信息学分析其基因组基本信息、基因间亲缘关系及启动子顺式元件，并对Seita.4G100300基因进行表达水平分析。[结果]发现谷子硒结合蛋白基因家族中基因启动子上游1 500 bp的调控元件具有响应胁迫的多种功能(ABA、Ethylene、GA、MeJA、Light、MYB、SA、热和低温等)；经过干旱处理，Seita.4G100300基因在GG和JF16中表达水平均增加，且其在耐干旱品种GG中表达水平的增幅显著大于干旱敏感品种JF16。[结论]谷子硒结合蛋白基因家族在氨基酸序列和表达模式方面具有较为丰富的多样性。本研究有助于我们理解硒结合蛋白的结构和功能，为进一步研究硒结合蛋白与植物抗逆性关系提供理论依据。

谷子；硒结合蛋白；抗旱性

谷子(Setariaitalica)，为禾本科狗尾草属植物，也称小米、粟，是重要的小杂粮作物，富含氨基酸、脂肪酸和矿物质等，在人们的生活中起重要作用[1，2]。据统计，我国约有三分之一的土地处于干旱区[3]，范围广、持续时间长的干旱对我国北方农作物的产量和品质造成严重影响。虽然谷子是抗旱作物，但是干旱也会严重影响谷子的产量，例如谷子灌浆期处于干旱天气时，会出现大量秕谷，造成严重减产[4]。目前关于干旱与谷子关系的研究主要集中在性状、产量、基因鉴定及其在干旱胁迫下的表达分析等方面[5，6]。

硒(Selenium)是人体必需的重要微量元素之一，是保持机体平衡的抗氧化剂；硒结合蛋白(Selenium-binding protein)是硒元素在体内的存在形式，其在肿瘤治疗方面起重要作用[7]。在15 % PEG-6000胁迫下，亚硒酸盐能够促进小麦种子萌发与硒提高萌发种子的干旱胁迫抗性有关[8]。但目前还没有谷子硒结合蛋白基因与其抗旱性关系的相关报道，本研究对谷子硒结合蛋白基因进行生物信息学分析，了解其基本信息，以便进行后续研究。

1 材料与方法

1.1 研究材料

耐旱品种GG(勾勾母鸡咀)和干旱敏感品种JF16(晋汾16)由山西农业大学提供。

GG和JF16置于14 h光照28 ℃/10 h黑暗23 ℃的人工气候室中培养，出苗21 d后，进行20 % PEG-6000干旱胁迫0.5 h，用蒸馏水处理0.5 h做对照，两者均随机取3株幼苗并提取RNA，进行表达谱分析。

1.2 研究方法

根据转录组数据，在NCBI中查找玉米硒结合蛋白基因编号gi|413957085|gb|AFW89734.1|，得到硒结合蛋白氨基酸序列，利用Blast search寻找谷子中硒结合蛋白基因的基本信息，利用http://web.expasy.org/compute_pi/ 预测硒结合蛋白的理化性质，利用MEGA 7.0进行氨基酸序列的多序列比对，构建系统发育树，利用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/进行启动子元件分析；利用SPSS 软件对启动子顺式元件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 谷子硒结合蛋白基因基本信息及理化性质分析

由表1可见，本文研究的10个硒结合蛋白基因中，最多只有1个内含子，大部分基因均没有内含子；10个基因分布在7条染色体上，其中1、2、5号染色体分别分布2个基因，其余均分布1个基因；氨基酸数目为548～695 aa，平均602.1 aa；CDS序列长度为1 647～2 088 bp，平均1 809.3 bp，且基因Seita.7G139500 的CDS序列长度与氨基酸序列长度均最长，基因Seita.1G301800的CDS序列长度与氨基酸序列长度均最短；硒结合蛋白基因等电点为5.99～8.59，平均7.763；蛋白质分子量为58 903.80～68 350.96 kDa，平均为66 257.109 kDa。

表1 谷子硒结合蛋白基因的基本信息及蛋白的理化性质

2.2 谷子硒结合蛋白基因家族系统进化树

从图1看出，硒结合蛋白基因家族大致分为两类，其中Seita.2G405600、Seita.1G301800、Seita.2G031700、Seita.7G139500、Seita. 4G100300、Seita. 5G295500为一类，其余为另一类。其中，Seita.2G405600与Seita.1G301800处于同一分支，其亲缘关系较近；Seita.2G031700与Seita.7G139500处于另一分支，其亲缘关系较近。

图1 谷子硒结合蛋白基因家族系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of selenium-binding family in foxtail millet

2.3 谷子硒结合蛋白基因家族启动子元件及功能

利用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/对硒结合蛋白基因启动子上游1 500 bp进行启动子元件分析,结果见表2。由表2可知，硒结合蛋白基因的顺式作用元件具备多种胁迫响应的功能(ABA、MeJA、Ethy、GA、MYB、SA)。

根据谷子硒结合蛋白基因家族启动子顺式元件预测(表3)，得出所有基因均含具有Light(光响应)功能的调控元件，其中基因Seita.5G295500具有Light功能的调控元件最少，数量为5，而基因Seita.5G124400具有Light功能的调控元件最多，数量高达26；除Seita.4G100300，其他基因均具有与干旱相关MYB结合位点功能的调控元件，其中40%的基因均含3个具有MYB功能的作用元件；除Seita.5G295500 和Seita.1G191400，其他基因均含2～8个具有MeJA(茉莉酸甲酯)功能的调控元件；60%的基因含具有ABA(脱落酸)功能的响应元件；50%的基因含具有SA(水杨酸)功能的调控元件，且此调控元件数量为1或2；仅有40%的基因含具有热响应功能的调控元件，其中此作用元件的数量仅为1或2；只有Seita.4G100300基因含具有Ethy(乙烯)功能的调控元件，其他均无。

表2 谷子硒结合蛋白基因启动子顺式作用元件

Table 2 Cis-acting elements in promoters of selenium-binding protein genes in foxtail millet

功能Function调控序列名称Nameofregulatorysequence核心序列CoresequenceABAABREGCCGCGTGGCMeJACGTCA-motifCGTCATGACG-motifTGACGEthyEREATTTCAAAGAGARE-motifAAACAGATATC-boxTATCCCAP-boxCCTTTTGMYBMBSCAACTGMREAACCTAASACCAAT-boxCAACGGTCA-elementGAGAAGAATA热响应HSEAGAAAATTCG胁迫响应TC-richrepeatsATTCTCTAAC厌氧诱导响应ARETGGTTTGC-motifCCCCCG低温响应LTRCCGAAA热响应HSEAAAAAATTTC

2.4 谷子硒结合蛋白基因在干旱胁迫下的表达模式

用20 % PEG-6000模拟干旱胁迫，处理GG和JF16，根据转录组表达谱结果，发现GG和JF16基因组中均含1个硒结合蛋白基因(Seita.4G100300)，此硒结合蛋白基因在GG和JF16的表达模式见图2。由图2可知，在浇水与干旱条件下，Seita.4G100300基因在GG和JF16中均表达。在正常浇水状况下，Seita.4G100300基因在JF16中表达水平高于GG;而在干旱胁迫下，Seita.4G100300基因在JF16中相对表达水平低于GG。经过干旱处理，此基因在GG和JF16中表达水平均相应增加，但其在耐干旱品种GG的表达水平增幅显著大于干旱敏感品种JF16。

表3 谷子硒结合蛋白基因家族具有抗逆相关功能的启动子顺式元件数目预测

Table 3 The prediction of number of cis-acting elements with functions related to stresses in selenium-binding protein genes in foxtail millet

基因名称Gene与胁迫有关调控元件的功能FunctionsofregulatoryelementsrelatedtostressABAEthyGAMeJALightMYBSA热响应Heatstressresponsiveness低温响应Low-temperatureresponsiveness胁迫响应DefenseandstressresponsivenessSeita.4G10030021222100102Seita.8G25050000041320000Seita.2G40560010041730002Seita.5G12440070322630000Seita.5G2955001010530010Seita.1G19140000001122011Seita.2G03170000141121210Seita.7G13950030041832100Seita.6G05960010221412002Seita.1G30180000181841100

注：以上数据不包括基本启动子元件TATA-box和CAAT-box。

Note: The data does not include the basic promoter elements such as TATA-box and CAAT-box.

图2 GG和JF16硒结合蛋白基因的表达模式Fig.2 Expression profiles of selenium-binding genes in GG and JF16

图3 谷子硒结合蛋白基因家族启动子顺式元件聚类分析Fig.3 Clustering analysis for cis-acting elements of the promoterin selenium-binding protein genes in foxtail millet

3 结论与讨论

利用SPSS 软件对预测的谷子硒结合蛋白基因家族启动子顺式元件进行聚类分析(图3)，使具有相似时空表达活性特征的基因聚到一起，进而揭示基因生物学功能的相似性。结果发现Seita.2G405600和Seita.8G250500基因聚集，Seita.7G139500和Seita.1G301800基因聚集，Seita.5G295500和Seita.1G191400基因聚集，这些相互聚集的基因可能具有相似的抗逆响应。而据谷子硒结合蛋白基因家族系统进化树(图1)，得出Seita.2G405600和Seita.1G301800基因亲缘关系相近，Seita.7G139500和Seita.2G031700基因亲缘关系相近，Seita.5G295500和Seita.4G100300基因亲缘关系相近。根据氨基酸序列得到的亲缘关系与根据启动子顺式元件预测得到的聚类分析的结果不一致。这是因为氨基酸序列会反映蛋白质的结构与活性，而启动子调控元件则反映启动子对多种因子的响应和基因表达活性。氨基酸序列相似的基因其启动子序列可能不同，则其蛋白质表达时空模式就不同。因此，谷子硒结合蛋白基因家族在氨基酸序列和表达模式方面(从启动子特征推测)具有较为丰富的多样性。

在干旱胁迫下，硒能够刺激作物产生抗氧化剂，减少植物氧化导致的损伤，提高作物叶绿素含量，调节植物水分状况等，从而可以使处于干旱胁迫下作物的品质和产量均得到改善[9,10]。但其只是从生理生化水平对硒及作物抗旱的关系进行研究，尚未进行分子机理的研究。本试验发现谷子具有硒结合蛋白基因，而且在干旱胁迫下(同正常浇水相比)，谷子硒结合蛋白基因家族成员中Seita.4G100300基因在耐干旱品种GG中表达水平的增幅显著大于干旱敏感品种JF16(图2)，这可能是由于抗旱品种中较多的硒结合蛋白在干旱胁迫时发挥了重要保护作用，但仍需后续对其他干旱和敏感品种进行广泛而深入的研究以确定其功能。

综上所述，本研究通过对谷子硒结合蛋白基因进行生物信息学分析，并对硒结合蛋白基因成员中的一个基因进行表达水平分析，有助于我们理解硒结合蛋白的结构和功能，为硒结合蛋白与植物抗逆性关系研究提供理论基础。

[1]张义茹,张彬,马芳芳,等.小米吸水特性及其与蒸煮时间的相关性[J].农学学报,2015,5(2):86-91.

[2]He L, Zhang B, Wang X C, et al. Foxtail millet: nutritional and eating quality, and prospects for genetic improvement[J]. Frontiers of Agricultural Science and Engineering,2015,2(2):124-133.

[3]李磊,贾志清,朱雅娟,等.我国干旱区植物抗旱机理研究进展[J].中国沙漠,2010,30(5):1053-1059.

[4]张雁明,刘晓东,马建萍,等.谷子抗旱研究进展[J].山西农业科学,2013,41(3):282-285.

[5]王永丽,王珏,杜金哲,等.不同时期干旱胁迫对谷子农艺性状的影响[J].华北农学报,2012,27(6):125-129.

[6]赵晋锋,余爱丽,田岗,等.谷子CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析[J].作物学报,2013,39(2):360-367.

[7]张锦,董卫国.人硒结合蛋白1在肿瘤发生发展中的作用[J].肿瘤防治研究,2010,37(11):1327-1329.

[8]郁飞燕.干旱胁迫下硒对小麦种子萌发的影响[D].洛阳：河南科技大学, 2012.

[9] Ahmad R, Waraich E A, Nawaz F, et al. Selenium (Se) improves drought tolerance in crop plants-a myth or fact?[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2016, 96(2): 372-80.

[10]Nawaz F, Naeem M, Ashraf M Y, et al. Selenium Supplementation Affects Physiological and Biochemical Processes to Improve Fodder Yield and Quality of Maize (Zea mays L.) under Water Deficit Conditions [J]. Frontiers in Plant Science，2016,7:1438.

(编辑：马荣博)

Selenium-binding protein gene family and its relationship with drought tolerance in foxtail millet

Wu Caijuan1, Su Yanbing1, Cheng Lu1, Wang Yijie1, Yuan Xuzhao1, Gao Wei1, Li Hongying1,2,3*

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.KeyLabaratoryofCropGeneResourcesandGermplamEnhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,Taiyuan030031,China; 3.ShanxiKeyLaboratoryofGeneticResourcesandGeneticImprovementofMinorCrops,Taigu030801,China)

[Objective]Selenium in soil and fertilizer becomes selenium-binding protein when it is absorbed by plants and then combined with proteins and active organic ingredients.Based on the structure and function of selenium-binding protein, the study explored the relationship between it and drought tolerance.[Methods]In the study, drought tolerant variety (GG) and drought sensitive variety (JF16) were used as test materials, and 10 genes of selenium-binding protein gene family were studied. Using bioinformatics, the basic information of the genes, the genetic relationship among the genes and the cis-acting elements in promoters were analyzed. The expression pattern of theSeita.4G100300 gene was analyzed.[Results]It was found that the regulatory elements within the upstream 1500 bp in promoter of selenium-binding protein gene family in foxtail millet had the functions of responding to multiple stresses (ABA, Ethy, GA, MeJA, Light, MYB, SA,heat, low temperature). After drought tolerance, the expression levels ofSeita.4G100300 gene increased in both GG and JF16. And the rise of expression level in GG (drought tolerant variety) was significantly higher than that in JF16 (drought sensitive variety).[Conclusion]The selenium-binding protein gene family has rich diversity in the amino acid sequence and expression pattern. The study will help us to understand the structure and function of selenium-binding protein. And it will provide a theoretical basis for the further study of the relationship between selenium-binding protein and plant stress resistance.

Foxtail millet， Selenium-binding protein， Drought tolerance

2016-08-29

2016-10-14

武彩娟(1993-)，女(汉)，山西太原人，硕士研究生，研究方向：谷子抗旱机理

*通讯作者：李红英，教授，博士生导师。Tel: 0354-6286680; E-mail: swgctd@163.com

国家自然科学基金(31471556)；山西农业大学科技创新基金(2014022.2014YZ2-5)

S515；Q94

A

1671-8151(2016)12-0850-05