基于microRNAs调控的轻度慢性乙型肝炎炎症活动的分子机制研究*

张传涛,黄 群,刘业方，郭尹玲，辜海英，王芳瑜，胡 蓉，扈晓宇△，郑政隆

(1.成都中医药大学附属医院感染科，成都 610072；2.成都中医药大学，成都 610075；3.成都市传染病医院肝病科,成都 610066)



·生物信息学·

基于microRNAs调控的轻度慢性乙型肝炎炎症活动的分子机制研究*

张传涛1，2,黄 群2,刘业方2，郭尹玲2，辜海英1，王芳瑜2，胡 蓉3，扈晓宇1△，郑政隆2

(1.成都中医药大学附属医院感染科，成都 610072；2.成都中医药大学，成都 610075；3.成都市传染病医院肝病科,成都 610066)

目的 研究从microRNAs角度揭示轻度慢性乙型肝炎炎症活动的分子机制。方法 将符合标准的病例分为轻度慢性乙型肝炎组与慢性HBV携带者组，借助Agilent Human microRNA 8×60 k微阵列芯片检测血浆中microRNAs表达谱，求得两组间的差异表达microRNAs谱(P<0.05)，借助microRNAs生物信息学分析软件预测其靶基因并对靶基因进行GO功能富集分析和pathway分析。结果 两组间的差异表达microRNAs共65条(P<0.05)，38条上调，27条下调；GO分析及pathway分析得到其功能主要涉及细胞增殖、生物黏附、生物合成过程的正/负调控、大分子生物合成过程中的正/负调控、蛋白氨基酸的磷酸化、RNA的生物合成过程、Wnt信号通路、MAPK 信号通路、Notch信号传导途径、Hedgehog信号通路、T细胞受体信号通路、TGF-β信号通路、mTOR信号通路、趋化因子信号通路JAK-STAT信号通路、钙离子信号通路等。结论 轻度慢性乙型肝炎炎症活动受特异性microRNAs调控，其涉及多个生命过程及通路。

轻度慢性乙型肝炎；炎症活动；microRNAs调控

全球约20亿人曾感染乙型肝炎病毒(HBV)，其中2.4亿人为慢性HBV感染者[1]，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌[2]。2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明，我国1～59岁一般人群HBsAg携带率为7.18%[3-4]。2014年全国1～29岁人群乙型肝炎血清流行病学调查结果显示:1～4岁、5～14岁和15～29岁人群HBsAg流行率分别为0.32%、0.94%和4.38%。虽然我国HBV感染率明显下降，但是我国仍是肝病高发地区，仍严重影响我国人民健康的疾病，为社会带来巨大的经济负担。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类具有单链小分子RNAs，调控人体近1/3基因的功能[5]，miRNAs参与HBV感染后病毒与宿主之间的相互作用，能够调控HBV复制、细胞外基质生成及抑癌基因的沉默等过程[6-8]。深入研究miRNAs调控网络有望为进一步丰富HBV感染的发病机制。本研究借助Agilent Human miRNA 8×60 k微阵列芯片技术，从miRNAs调控角度揭示慢性乙型肝炎(简称“慢乙肝”)炎症活动的机制，为今后控制慢乙肝肝脏炎症活动、抗HBV药物研发等提供研究方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例均来自成都市传染病医院等中心2012年8月至2013年4月门诊，分为：携带者8例，轻度慢性乙型肝炎8例。纳入标准： (1)符合轻度慢乙肝与慢性HBV携带者诊断；(2)就诊前3个月内未进行过中西医抗病毒及保肝等治疗；(3)患者的HBV-DNA为阳性；(4)年龄20～40岁；(5)同意并签署知情同意书者；只有以上入选标准都满足者，才能纳入本临床研究。轻度慢乙肝与携带者诊断标准：参照中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病分会联合制定《病毒性肝炎防治方案》(2000年修订版)拟定轻度慢乙肝诊断标准[9]。参照中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病分会联合制定《慢性乙型肝炎防治指南》(2005年版)拟定慢性HBV携带者诊断标准[10]。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器及试剂 微阵列扫描仪(安捷伦，批号：P/N G2565BA)、不锈钢杂交室(安捷伦，批号：P/N G2534A)、杂交室垫片幻灯片8微阵列(安捷伦，批号：P/N G2534A)、miRNA的完整标签和HYB套件(安捷伦，批号：P/N 5190-0456)基因表达的洗涤液套装(安捷伦，批号：P/N 5188-5327)、2100生物分析仪(安捷伦，批号：P/N g2938A)、RNA 6000纳米试剂盒(安捷伦，批号：P/N 5067-1511)。

1.2.2 实验方法 用血常规管 (EDTA抗凝)采取符合标准患者肘静脉血10 mL，4 ℃静置30 min，3 000 r/min离心20 min，提取血浆，RNA抽提，质控合格，标记、杂交，Agilent Human miRNA 8×60 k微阵列芯片技术检测，芯片洗涤、扫描，在线SAS系统中的“DiffGene”项目行T检验和SAM筛选，对筛选出来2倍以上表达差异的miRNAs利用miRNA生物信息学分析软件进行靶基因预测，将筛选出来的靶基因行GO功能富集基因的分类和pathway分析。

1.3 统计学处理 差异miRNAs筛选采用在线SAS系统分析(http://www.ebioservice.com)。比较采用配对t检验，miRNAs表达组间比较进行方差分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 差异表达miRNAs谱 将归一化文件导入SAS系统中，轻度慢乙肝与慢性HBV携带者两组间的差异表达miRNAs共65条(P<0.05)，38条上调，27条下调；2倍以上差异表达的miRNAs 30条，19条上调，11条下调。上调的19条为:hsa-miR-1246、hsa-miR-3679-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-1268、hsa-miR-126、hsa-miR-4298、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-4270、hsa-miR-320c、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-223、hsa-miR-1202、hsa-miR-3162、hsa-miR-27a、hsa-miR-1915、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-3195、hsa-miR-4281等。下调的11条为：hsa-miR-26a、hsa-miR-29a、hsa-miR-1238、hsa-miR-720、hsa-miR-122、hsa-miR-1228、hsa-miR-1280、hsa-miR-1281、hsa-miR-1234、hsa-miR-191*、hsa-miR-20a等。

2.2 差异miRNAs靶基因GO功能分析 利用miRNA生物信息学分析软件miRDB,microRNA,TarBase等对两组间2倍以上的差异miRNAs进行靶基因预测，利用DAVID在线软件对所预测的靶基因进行GO功能富集分析。

上调的差异miRNAs所对应的靶基因共参与61项显著生物功能(表1)，主要包括细胞增殖、生物黏附、细胞黏附、细胞内的信号级联、蛋白质转运、蛋白定位、大分子生物合成过程中的积极调控、大分子代谢过程正调控、氮化合物的代谢过程的正调控、生物合成过程中的正/负调控、细胞凋亡、蛋白氨基酸的磷酸化、细胞周期、细胞迁移等下调的差异miRNAs所对应的靶基因共参与76项显著生物功能(表2)，包括转录调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、基因表达的正/负调控、转录正/负调控、大分子代谢过程正/负调控、RNA代谢过程正调控、氮化合物的代谢过程的正调控、细胞生物合成过程中的积极调控、酶联受体蛋白信号通路、细胞增殖、细胞迁移、蛋白质定位、细胞运动、Wnt受体信号通路、钾离子转运、RNA的生物合成过程及核碱基、核苷、核苷酸和核酸的代谢过程的正调控等。

2.3 差异 miRNAs靶基因调控的Pathway分析 轻度慢乙肝组/慢性HBV携带者组上调差异miRNAs的靶基因参与的显著性信号通路28条(图1)，包括黏着、轴突导向、胞吞作用、心脏相关疾病(肥厚性心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右室心肌病等)、肌动蛋白骨架的调节、白细胞跨内皮迁移、Janus激酶(JAK)-信号转导子和转录激活子(STAT)信号传导途径、神经营养因子信号通路、Wnt信号通路、Notch信号传导途径、胰岛素信号通路、转化生长因子-β(TGF-β)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、p53信号通路等。

表1 轻度慢乙肝组/慢性HBV携带者组上调差异miRNAs的靶基因GO分析

表2 轻度慢乙肝组/慢性HBV携带者组下调差异miRNAs的靶基因GO分析

轻度慢乙肝组/慢性HBV携带者组下调差异miRNAs的靶基因参与的显著性信号通路51条(图2)，包括白细胞跨内皮迁移、Hedgehog信号通路、II型糖尿病、脑胶质瘤、促性腺激素释放激素信号传导途径、黑色素生成、肾细胞癌、T细胞受体信号传导途径、卵母细胞减数分裂、钙信号传导途径、肌动蛋白骨架的调节、神经营养因子信号传导途径、扩张型心肌病、胰岛素信号传导途径、慢性髓细胞样白血病、Notch信号传导途径、泛素介导性蛋白酶解、缝隙连接、ErbB信号传导途径、粘着斑、粘着连接、长时程增强、癌症途径、紧密连接、胞吞作用、MAPK信号传导途径、Wnt信号通路、轴突导向、Notch信号通路、mTOR信号通路、p53信号通路、O-聚糖的生物合成、脂肪细胞因子信号通路、趋化因子信号通路、TGF-β信号通路、癌症途径(大肠癌、肾细胞癌、小细胞肺癌等)等。

图1 轻度慢乙肝组/慢性HBV携带者组上调差异 miRNAs的靶基因通路

图2 轻度慢乙肝组/慢性HBV携带者组下调差异 miRNAs的靶基因通路

3 讨 论

本研究借助Agilent Human miRNA 8×60 k微阵列芯片技术筛选慢乙肝组与慢性HBV携带者组之间差异miRNAs谱，其中显著性(2倍以上)差异表达30条，19条上调，11条下调。进一步借助miRNA生物信息学分析软件DAVID对差异miRNAs预测靶基因功能进行GO富集分析发现，其功能主要涉及生物黏附、氮化合物的代谢过程的正/负调控、生物合成过程的正/负调控、大分子生物合成过程中的积极调控、细胞生物合成过程中的正/负调控、蛋白氨基酸的磷酸化、基因表达的正/负调控、Wnt受体信号通路、钙离子转运等生命过程。KEGG分析结果提示其主要涉及Notch信号通路、钙信号通路、Hedgehog信号通路、mTOR信号通路、p53信号通路、O-聚糖的生物合成、轴突导向、脂肪细胞因子信号通路、趋化因子信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、胰岛素信号通路、神经营养因子信号通路、T细胞受体信号传导途径、TGF-β信号通路等。

本研究发现miRNA可以影响JAK-STAT信号传导途径，HBV及其抗原成分能够选择性地抑制干扰素α(interferon-α)JAK-STAT信号传导途径分子和抗病毒蛋白的表达。IFN-αJAK-STAT信号传导途径分子STAT1的下调表达可能是HBV抑制IFNα抗病毒活性的机制之一[11]。作者推测特异性microRNA可能调控了JAK-STAT信号传导途径增强了IFN-α作用，增强机体免疫，进步引起肝脏炎症活动。本研究发现miR-320c可能参与Wnt信号通路、TGF-β信号通路、细胞周期、MAPK信号通路等，TGF-β1诱导的肝星状细胞细胞及HepG2细胞中Smad3C及Smad3L磷酸化、进而促进Smad2/3/4复合物形成，及其转位入核和靶基因1型纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)mRNA表达可能是肝纤维化-肝癌发病的重要机制，肝纤维化中MAPK信号通路能够对肝星状细胞活性产生影响[12]。MAPK抑制因子均能明显抑制HSC细胞内TGF-β1诱导的靶基因PAI-l mRNA的表达,MAPK通路参与HSC细胞内TGF-β1信号通路靶基因PAI-1转录活性的调控而影响肝纤维化。作者推测特异性miRNA通过影响MAPK通路调控下经TGF-β1/Smad 信号途径而影响慢乙肝向肝纤维化发展，这为今后开展防治乙肝后肝纤维化提供思路[13]。Th17作为一种新发现的辅助性T细胞(Helper T cells,Th)，参与乙型肝炎疾病的病程发展和转归[14-15]。PI3K/AKt/mTOR信号通路参与Th17的增殖、分化[16],此信号通路的过度激活可导致正常细胞的自噬和凋亡紊乱，PI3K/AKt/mTOR信号通路可能激活Th17，促使CHB向肝硬化、肝细胞癌发展，推测特异性miRNA调控mTOR信号通路参与了慢乙肝炎症活动进展为肝硬化、肝癌进程。阻断Notch信号通路可减少慢性乙型肝炎患者外周单个核细胞Foxp3 mRNA的表达，Notch信号通路可能是持续感染的一个因素[17]，推测miRNA调控Notch信号通路可能是HBV持续感染的作用机制之一。另外，本研究发现差异microRNA还影响了细胞增殖、生物黏附、细胞粘附、蛋白质转运、建立蛋白定位、大分子生物合成过程中的积极调控、氮化合物的代谢过程的正调控、生物合成过程中的正/负调控、细胞凋亡、蛋白氨基酸的磷酸化、转录调控、基因表达的正/负调控、RNA的生物合成等多个生命过程，这些影响在慢乙肝炎症活动中的作用仍需进一步验证。

总之，本研究得到慢乙肝炎症活动的差异miRNAs谱，初步揭示慢乙肝炎症活动(打破免疫耐受状态)机制，这些差异miRNAs可能作为慢乙肝炎症活动或其他肝脏相关疾病的潜在生物学标志物，但仍需进一步验证研究。

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Study on molecular mechanism of mild chronic hepatitis inflammatory activity based on microRNAs regulation*

ZhangChuantao1,2,HuangQun2,LiuYefang2,GuoYinling2,GuHaiying1,WangFangyu2,HuRong3,HuXiaoyu1△,ZhengZhenglong2

(1.DepartmentofInfection,AffiliatedHospitalofChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610072,China;2.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;3.DepartmentofLiverDiseases,ChengduInfectiousDiseaseHospital,Chengdu,Sichuan610066,China)

Objective To reveal the molecular mechanism of inflammatory activity of mild chronic hepatitis B from the perspective of microRNAs regulation.Methods The cases conforming to the standard were divided into the mild chronic hepatitis B group and chronic HBV carriers group.The Agilent Human miRNA 8×60 k microarray chip was used to detect the expression profiles of microRNAs in plasma in order to achieve different expression spectrum of microRNAs between the two groups (P<0.05).Then the miRNA bioinformatics analysis software was used to predict the target gene,and did target genes GO functional enrichment analysis and pathway analysis.Results A total of 65 microRNAs bands were differentially expressed between the two groups (P<0.05),38 bands were up-regulated,27 bands were down-regulated.The GO analysis and Pathway analysis showed that the function mainly involved in cell proliferation,bioadhesion,positive/negative regulation of biosynthesis,positive/negative regulation of macromolecular biosynthesis,phosphorylated of protein amino acids,biosynthesis of RNA,Wnt signaling pathway,MAPK signaling pathway,Notch signaling transduction pathway,Hedgehog signaling pathway,T cell receptor signaling pathway,TGF-β signaling pathway,mTOR signaling pathway,chemokine signaling pathway,JAK-STAT signaling pathway,calcium ion signaling pathway,etc.Conclusion The inflammatory activity of mild chronic hepatitis B is regulated by specific microRNAs,involving multiple life processes and pathways.

mild chronic hepatitis B;inflammatory activity；microRNAs regulation

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.021

国家自然科学基金资助项目(81202624)。 作者简介：张传涛(1981-)，副主任医师，博士，从事肝病及感染病研究。△

R512.6+2

A

1671-8348(2016)32-4527-04

2016-05-03

2016-07-29)