芒柄花黄素对人胃癌细胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及机制研究*

董陈诚,钟 漓,张广钰,王振冉,冉福林,陈 霄

(桂林医学院附属医院胃肠外科，广西桂林 541002)



论著·基础研究

芒柄花黄素对人胃癌细胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及机制研究*

董陈诚,钟 漓△,张广钰,王振冉,冉福林,陈 霄

(桂林医学院附属医院胃肠外科，广西桂林 541002)

目的 研究芒柄花黄素对人胃癌细胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及作用机制。方法 建立人胃癌MKN-45细胞荷瘤裸鼠癌症模型，经环磷酰胺(20mg/kg)和芒柄花黄素(10、20、40mg/kg)干预14d，观察荷瘤重量变化及应用TUNEL染色评估荷瘤组织中细胞凋亡数量，并用蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测荷瘤内源性p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及细胞周期蛋白(CyclinD)表达。结果 与模型对照组比较，芒柄花黄素明显抑制胃癌细胞MKN-45荷瘤裸鼠肿瘤的生长(P<0.01)，并且肿瘤组织中细胞凋亡计数增加(P<0.01)。同时，芒柄花黄素干预组肿瘤组织中的p38MAPK蛋白表达增加,CyclinD蛋白水平减少 (P<0.01)。结论 芒柄花黄素具有明显抑制胃癌细胞MKN-45增殖作用，其机制与激活细胞内MAPK信号转导通路而诱导细胞凋亡有关。

芒柄花黄素；胃肿瘤；细胞凋亡

胃癌病死率较高，是仅次于食道癌的常见恶性肿瘤之一[1]。当前，胃癌治疗一般采用手术、放射或化学疗法，但进展期胃癌的单纯手术治疗可能会存在肉眼或镜下残留灶，使复发转移率大大增加[2]。目前临床上使用的烷化剂类抗肿瘤药环磷酰胺，在肝微粒体酶系催化下代谢转化为烷化作用更强的氯乙基磷酰胺，能发挥细胞毒作用而杀灭肿瘤细胞，但其有着毒副作用较大的缺点[3]。近年发现，细胞内促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路与调控细胞增殖、分化和细胞凋亡密切相关，因此抑制该信号通路是药物抗癌作用的新导向[4]。芒柄花黄素，又名刺芒柄花素，具有抗癌药理活性，可防治前列腺癌及乳腺癌等癌症，同时具有降血脂和抗氧化作用[5]。本实验首先建立人胃癌细胞MKN-45荷瘤裸鼠动物模型，然后探讨芒柄花黄素对胃肿瘤细胞的抗增殖活性，进而阐明其抗癌作用机制并为今后的临床开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 MKN-45人胃癌细胞株购自中科院上海细胞生物所细胞库。将MKN-45培育在DMEM培养基(含10%胎牛血清，150 U/mL青霉素和120 U/mL的链霉素)，于5%CO2、37 ℃条件下培养。雄性BALB/c裸鼠，18～20 g，购自广东省医学实验动物中心。动物饲养在良好的实验控制环境中，标准化的饲料喂养和科学化的管理。

1.2 药物与试剂 芒柄花黄素(纯度大于98.0%)：上海佳和生物科技有限公司。环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司。DMEM培养基：美国Gibico公司。胎牛血清：美国Gibico公司。胰蛋白酶：上海Sigma-Aldrich公司。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒：上海碧云天生物技术研究所。DAB(3，3-二氨基联苯胺)染色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。p38分裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)、细胞周期蛋白(CyclinD)及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：上海Sigma-Aldrich公司。蛋白裂解液:上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 HWS-150恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)。 Series8000 直热式CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)。W-CJ-1CU双人单面水平超净工作台(南京莱步仪器有限公司)。SpectraMax 190全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)。 DM IRB(型号)倒置显微镜(德国Leica仪器有限公司)。ECL(电子化学发光)检测系统(美国Thermo Scientific公司)。GelDoc 2000 伯乐凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 荷瘤动物与药物干预 将0.1 mL无菌MKN-45细胞(3×107个/mL)皮下注射到裸鼠体内，观察肿瘤生长情况。当移植肿瘤长到直径约20 mm时，MKN-45荷瘤裸鼠被分为5组：模型对照组，环磷酰胺(20 mg/kg)阳性组和芒柄花黄素(10、20、40 mg/kg)给药组，每天腹腔注射1次，持续14 d。同时记录实验裸鼠体质量(W)与肿瘤质量，并计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(%)=(1-W给药/W模型)×100%。

1.4.2 指标检测 分离皮下肝癌肿瘤组织，应用TUNEL染色评估肿瘤组织中细胞凋亡数，并用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肿瘤内源性p38MAPK及CyclinD蛋白的表达。实验步骤操作均按照试剂供应商说明书严格进行。

2 结 果

2.1 芒柄花黄素对荷瘤裸鼠肿瘤增殖的影响 实验结果表明，芒柄花黄素能抑制胃癌细胞MKN-45荷瘤裸鼠肿瘤的生长，随着芒柄花黄素浓度的增加肿瘤质量不断减小，呈剂量依赖性，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 芒柄花黄素抑制MKN-45荷瘤裸鼠 肿瘤增殖

*：P<0.01，与对照组比较。

2.2 芒柄花黄素对荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响TUNEL染色结果显示，MKN-45荷瘤裸鼠肿瘤组织中模型对照组TUNEL阳性细胞数量较少。而芒柄花黄素(10、20、40mg/kg)组，TUNEL阳性细胞计数随浓度逐渐增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 芒柄花黄素增加MKN-45荷瘤裸鼠肿瘤组织TUNEL阳性细胞数量

*：P<0.01，与对照组比较。

2.3 芒柄花黄素对荷瘤裸鼠肿瘤组织CyclinD及p38MAPK蛋白表达的影响Westernblot结果表明，MKN-45荷瘤裸鼠内源性p38MAPK表达较低，处于抑制其表达状态，而CyclinD蛋白表达较高。经芒柄花黄素干预后，肿瘤组织中p38MAPK蛋白表达明显上调，而CyclinD蛋白水平明显减少，与对照组比较差别有统计学意义(P<0.01)，见图1。

*：P<0.01，与对照组比较。

图1 芒柄花黄素增加荷瘤裸鼠肿瘤组织p38MAPK水平及下调CyclinD表达

3 讨 论

目前，胃癌的病因至今未被完全阐明，但与直接或长期破坏胃黏膜屏障导致促癌因子被激活有关[6]。在癌变发展中，癌细胞失控生长会逐渐形成恶性癌，并进一步侵入附近组织[7]。目前的临床化疗药物疗效有限，并有很大的毒副作用。因此，寻找能抑制肿瘤生长并且高效低毒的药物一直是近年研究的热点。

在本研究中，以环磷酰胺和芒柄花黄素作用于MKN-45荷瘤裸鼠模型，结果相比MKN-45荷瘤裸鼠模型对照组，环磷酰胺和芒柄花黄素组的荷瘤裸鼠肿瘤组织减小，且肿瘤增殖抑制率与芒柄花黄素的剂量成正比，说明了芒柄花黄素能有效发挥抗肿瘤细胞增殖作用。在接下来的肿瘤组织TUNEL染色实验中作者发现，MKN-45荷瘤裸鼠模型对照组TUNEL阳性细胞计数显著减少，而环磷酰胺和芒柄花黄素组TUNEL阳性细胞数量增多，并且呈剂量依赖性，这与上述实验结果相一致，提示芒柄花黄素可能是通过诱导MKN-45细胞凋亡而抑制其增殖。

研究表明，p38MAPK激活时发生核转移，启动蛋白激酶和转录因子的磷酸化，同时p38通路介导的细胞凋亡过程通过细胞周期起作用，因此p38信号通路与细胞增殖、分化及细胞凋亡密切相关[8]。而CyclinD是调控细胞周期关键蛋白之一，当其过度表达可缩短G1期，并减少细胞对生长因子的依赖性。研究发现，CyclinD在人胃癌细胞中的表达较高，同时其阳性表达与癌症的恶性程度呈正相关性，其中CyclinD通过调控细胞内MAPK途径发挥负性调控作用，促进胃癌细胞的生长和转移趋势[9]。因此，调控肿瘤细胞内的MAPK信号通路或减少CyclinD表达有助于控制胃癌的发生、发展[10-11]。本研究的实验结果与以上的研究成果是相一致的。本研究中，经10、20、40mg/kg浓度的芒柄花黄素干预后，裸鼠肿瘤组织中p38MAPK蛋白水平明显上调，而CyclinD蛋白水平降低，肿瘤增殖受到明显抑制，因此笔者推测芒柄花黄素抑制胃癌细胞MKN-45增殖活性与激活细胞内MAPK信号通路而介导细胞凋亡有关。

综上所述，通过本研究，证明了芒柄花黄素能抑制胃癌细胞MKN-45生长，其作用机制与激活细胞内MAPK信号通路而介导细胞凋亡有关，为下一步临床应用于胃癌的治疗提供了理论基础。

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Inhibitory effect and mechanism of formononetin on nude mouse model bearing human gastric cancer cells MKN-45*

DongChencheng,ZhongLi△,ZhangGuangyu,WangZhenran,RanFulin,ChenXiao

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity，Guilin，Guangxi541002，China)

Objective To investigate the inhibitory effect of formononetin on the nude mouse model bearing human gastric cancer cells MKN-45 and its possible mechanism.Methods The nude mouse cancer model bearing human gastric cancer cells MKN-45 was established.Then the weight change of tumor bearing mouse was observed after 14 d intervention by 20 mg/kg of cyclophosphamide and 10,20,40 mg/kg of formononetin.The cellular apoptosis count was evaluated by using the TUNEL staining method.The endogenous p38MAPK and CyclinD protein expressions in tumor tissue were determined through the Western blot assay.Results Compared with model control group,formononetin significantly inhibited the growth of nude mouse bearing gastric cancer cells MKN-45 (P<0.01),moreover the cellular apoptotic count was increased (P<0.01).Meanwhile,expression of P38MAPK protein in the tumor tissue of formononetin intervention group was increased and the CyclinD protein level was decreased (P<0.01).Conclusion Formononetin has obviously inhibitory effect on the proliferation of gastric cancer cells MKN-45,its mechanism may be related with the activation of intracellular MAPK signal transduction pathway and inducing cellular apoptosis.

formononetin;gastric neoplasms;cellular apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.006

广西高校科学技术研究项目(LX2014270)。 作者简介：董陈诚(1981-)，副主任医师，硕士，主要从事胃肠肿瘤外科的研究。△

E-mail：zhongli0302@163.com。

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1671-8348(2016)32-4482-02

2016-05-18

2016-08-06)