白藜芦醇对卵泡颗粒细胞线粒体的调节作用及人工辅助生殖效果的影响

陈 兰，胡 沙 ，李素萍△

(1.湖北民族学院附属民大医院妇科，湖北恩施 445000；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉 430022)



白藜芦醇对卵泡颗粒细胞线粒体的调节作用及人工辅助生殖效果的影响

陈 兰1，胡 沙2，李素萍1△

(1.湖北民族学院附属民大医院妇科，湖北恩施 445000；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉 430022)

目的 探讨口服白藜芦醇对卵泡颗粒细胞线粒体功能及人工辅助生殖技术(ART)效果的影响。方法 研究入组受试对象109例，其中，对照组59例，白藜芦醇组50例。分析其颗粒细胞氧化应激水平和线粒体功能，检测胚胎发育和妊娠结局相关指标及不良反应。结果 白藜芦醇使颗粒细胞的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化活性下降了28.57%(P<0.05)，同时也降低了丙二醛(MDA)水平(0.653±0.084)nmol/mL vs. (0.382±0.052)nmol/mL，(P<0.05)。白藜芦醇增加了线粒体DNA(mtDNA)拷贝数(4.62±0.24)×105vs. (5.77±0.38)×105，(P<0.05)和ATP生成(2.516±0.160)pmol vs. (4.484±0.180)pmol，(P<0.05)。白藜芦醇组较之对照组其卵成熟率(87.75% vs. 94.15%，P<0.05)、受精率(86.69% vs. 91.49%，P<0.05)和优质胚胎率(44.30% vs. 51.22%，P<0.05)均显著提高，且尚未发现有明显的不良反应。结论 白藜芦醇可能对提高ART的成功率具有一定的辅助作用。

人工辅助生殖技术；白藜芦醇；颗粒细胞

人工辅助生殖技术 (assisted reproductive technology,ART) 是目前治疗不孕不育的重要方法之一。目前，全球1.1%～2.0%的新生儿依靠辅助生殖技术出生，这一技术的发展还在不断的进展中[1]。在ART的开展过程中，颗粒细胞 (granulosa cells,GCs) 对胚胎着床率和妊娠率具有重要的作用。颗粒细胞是组成卵泡的主要细胞成分，调节了卵母细胞的成熟及其胞核和胞质的正常分裂。而颗粒细胞线粒体的功能与卵母细胞的质量，以及女性生育能力具有密切的关系[2-3]。因此，调节线粒体功能可能是改善卵母细胞活性和提高ART成功率的有效途径之一。白藜芦醇(resveratrol,Res)是一种富含于桑葚、花生和葡萄等植物果实内的天然小分子多酚类物质，具有抗氧化、调节线粒体功能的作用[4]。有研究显示，Res对于体外培养的卵泡及受精卵均有正向的调节作用[5-6]，而口服Res对于颗粒细胞的作用及对ART成功率的影响尚鲜有报道。因此，本研究将就口服Res对志愿者卵泡颗粒细胞线粒体功能及ART的效果进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究选择2010年9月至2012年4月来武汉协和医院辅助生殖中心接受ART的患者120名，分为对照组和Res组各60名，均采用常规体外受精-胚胎移植术(IVF-ET)。所有入组对象均经过腹腔镜、子宫输卵管造影术、生殖内分泌检查、精液检查、遗传学检查及B超等相关检查，证实不育原因主要为输卵管盆腔因素、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征，符合IVF-ET术的适应证，并排除泌尿生殖系统感染、性传播疾病、遗传疾病、子宫疾患等禁忌证，排除男性少弱精症或无精症等对研究结果有影响的男方因素。患者均有意愿接受IVF-ET术，并告知药物可能产生的不良反应，签署知情同意书，告知受试对象在该项研究中具有自主权。Res组给予Res胶囊(GNC,美国)，500mg/d，连续服用6周，于取卵前停服。本研究入组受试对象120名，研究结束时保留受试对象109名，其中，对照组59名，Res组50名：对照组失访1例，Res组不能耐受治疗6例，失访4例。两组间患者年龄、不孕时间、基础卵泡数目、激素基础水平差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组一般情况比较

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案及颗粒细胞获取 所有入组对象均采用长方案控制性促排卵。(1)于黄体中期使用短效促性腺激素释放激素激动剂皮下注射(GnRH-a,triptorelin，德国辉凌)，剂量0.05mg/d。在此过程中，通过B超监测双侧卵泡数量及大小，使卵泡直径均小于8mm，如出现卵泡囊肿则B超引导下穿刺引流。(2)根据患者情况注射促性腺激素(Gn,珠海丽珠)，直至出现1个以上直径大于18mm的卵泡，予以肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(hCG,珠海丽珠) 10000U。注射hCG后36h，在异丙酚麻醉下经阴道超声引导穿刺取卵。取卵后1h使用透明质酸酶脱颗粒细胞，并将脱落颗粒细胞，2500r/min，离心10min，收集细胞团用于后续实验。卵泡行IVF，并于72h后移植卵裂期胚胎。移植4周后，行B超检查，以宫内见孕囊确定临床妊娠。

1.2.2 实验室检测 氧化应激水平由丙二醛(MDA)和还原型辅酶Ⅱ(NAPDH)活性反映。提取颗粒细胞团的蛋白，利用MDA试剂盒(南京建成，中国)测定MDA水平，使用NADPH氧化活性试剂盒(Genmed Scientifics,美国)。线粒体的ATP生成采用ATP检测试剂盒(碧云天，中国)分析。线粒体DNA(mtDNA)拷贝数比较采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法，以MT-ND1基因反映mtDNA的拷贝数，以HGB基因作为内参。ND1基因的引物如下。上游：5′-CCC TAA AAC CCG CCA CAT CT-3′，下游：5′-GAG CGA TGG TGA GAG CTA AGG T-3′；HGB基因的引物为：上游：5′-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3′，下游：5′-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3。MT-ND1扩增条件为：95℃ 10min，95℃ 15s 40个循环，60℃ 1min；HGB的扩增条件为：95℃ 10min，95℃ 15s 40个循环，56℃ 1min。

1.2.3 胚胎发育和妊娠结局的评价指标 本研究利用卵成熟率、受精率及优质胚胎率和临床妊娠率对胚胎发育及妊娠结局进行评价。卵成熟率=MⅡ卵数/获卵总数×100%；受精率= 2PN数/ MⅡ卵数×100%；优质胚胎率=Ⅰ～Ⅱ级胚胎数/获卵总数×100%；临床妊娠率=临床妊娠数/移植周期数×100%。

2 结 果

2.1 Res对颗粒细胞氧化应激水平的影响 口服Res使卵泡颗粒细胞的NADPH氧化活性下降了28.57%，并显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，Res组颗粒细胞的MDA水平(0.382±0.052)μmol/mL显著的低于对照组(0.653±0.084)nmol/mL，(P<0.05)，见图1。

2.2 Res对颗粒细胞线粒体功能的影响 Res显著的提高了卵泡颗粒细胞mtDNA的拷贝数，从对照组的(4.62±0.24)×105上升为(5.77±0.38)×105(P<0.05)。进一步研究发现，Res组线粒体ATP的合成(4.484±0.180)pmol显著高于对照组(2.516±0.160)pmol，其能量代谢水平较高(P<0.05)，见图2。

A：Res对颗粒细胞NADPH氧化活性的作用；B：Res对颗粒细胞MDA水平的作用。*:P<0.05，与对照组比较。

A：Res对颗粒细胞mtDNA的作用；B：Res对颗粒细胞ATP生成的作用。*:P<0.05，与对照组比较。

2.3 口服Res对胚胎发育和妊娠结局的作用 对照组移植59周期，Res组移植50周期，后者的卵成熟率由87.75%上升为94.15%，受精率由86.69%上升为91.49%，优质胚胎率由44.30%上升为51.22%，3项指标均显著高于对照组(P<0.05)。Res组的临床妊娠率为48.0%，高于对照组的44.1%，但二者间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 Res对胚胎发育及妊娠结局的影响

2.4 药物不良反应评价 对照组和Res组在畸胎率、死胎率及流产率上差异均无统计学意义(P>0.05)。孕妇发生妊娠高血压疾病和妊娠期糖尿病的比率在二组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 Res的不良反应评价[n(%)]

3 讨 论

Res作为一类天然小分子多酚类化合物，其抗氧化作用逐步受到民众的关注。近年来，较多的研究表明，Res与女性健康密切相关。有研究显示，Res具有类雌激素效应，可显著增加卵巢和子宫的湿质量，这一作用依赖于Res与雌激素α和β受体的结合[7-8]。本研究发现，口服Res(500mg/d，6周)可显著的降低卵泡颗粒细胞的氧化应激水平，增加颗粒细胞线粒体的合成和ATP生成。这一作用与前期的体外细胞实验相类似。早期研究显示，Res可通过抑制脂氧合酶和环加氧酶的活性，减少颗粒细胞的凋亡[9]。Sugiyama等[5]研究也指出Res通过增加颗粒细胞的线粒体生物合成和降解，从而对卵母细胞的生长发挥了积极的作用。而Res对颗粒细胞的抗氧化作用可能与抑制核因子κB(NF-κB)，抑制环加氧酶活性等作用有关[10]。

另一方面，研究发现，Res增高了IVF-ET后的卵成熟率、受精率及优质胚胎率；此外，Res组增高了临床妊娠率，但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。这与Res对颗粒细胞的积极作用有关。颗粒细胞对卵母细胞的成熟具有重要的作用[11]。同时，Res对于卵泡细胞亦有直接的保护作用。Res可减缓卵泡闭锁的过程，增加卵泡的储备量，延长卵巢的功能期[12]。Liu等[13]研究发现，给予老年小鼠Res后，改善了其卵巢的端粒酶活性、端粒长度和年龄相关基因的表达水平。此外，也有研究者认为，Res对于多囊卵巢综合征及IVF术后的卵巢过度刺激综合征同样具有预防作用，但仍需进一步证实[10]。

近期有报道指出，孕期使用Res可能对阻碍胎儿胰腺的发育，增加子代罹患糖尿病的风险[14]。本研究于ART前期给予患者口服Res，其不良反应尚未见报道。因此，笔者对口服Res的不良反应发生率进行了分析，结果发现，两组在畸胎率、死胎率、流产率及妊娠高血压疾病和妊娠期糖尿病的发生率上差异均无统计学意义(P>0.05)。而前期的动物实验同样也没有发现Res具有致畸等不良反应[15]。

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Effect of resveratrol on the granulosa cell mitochondrial function and ART pregnancy outcome

Chen Lan1,Hu Sha2,Li Suping1△

(1.Department of Gynaecology and Obstetrics,University Hospital of Hubei University for Nationalities,Enshi,Hubei 445000，China;2.Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science andTechnology,Wuhan,Hubei 430022,China)

Objective To explore the effect of resvertrol supplement to the granulosa cell mitochondrial function and assisted reproductive technology (ART) outcome.Methods The study would analyze the level of oxidative stress and mitochondrial function in granulosa cell from 109cases with or without resvertrol supplement,including 50cases in resvertrol group and 59cases as control group.The embryo quality,IVF-ET outcome and adverse reactions would be observed.Results Resveratrol reduced the NADPH oxidation activity of granule cells by 28.57%(P<0.05),and also decreased the MDA content (0.653±0.084)nmol/mL vs. (0.382±0.052)nmol/mL,(P<0.05).Moreover,resvertrol supplement improved the mitochondrial DNA copy number (4.62±0.24)×105vs. (5.77±0.38)×105,(P<0.05) and ATP production (2.516±0.160)pmol vs. (4.484±0.180)pmol,(P<0.05) in granulosa cell.Compared with the control group,the oocyte maturation rate (87.75% vs. 94.15%,P<0.05),fertilization rate (86.69% vs. 91.49%,P<0.05) and high quality embryo rate (44.30% vs. 51.22%,P<0.05) in the resveratrol group were significantly increased.Meanwhile,the resvertrol supplement did not show any adverse effect.Conclusion Resvertrol might be a adjunctive therapy to the ART.

assisted reproductive technology；resvertrol；granulosa cell

陈兰(1980-)，主治医师，本科，主要从事辅助生殖技术的应用研究。△

论著·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.016

R71

A

1671-8348(2016)29-4080-03

2016-02-22

2016-04-11)