小鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和分化为神经元样细胞的实验研究

朱晓瓞， 余资江， 孙宝飞， 余 彦， 李玉美， 罗时鹏， 肖朝伦， 贺菊芳



小鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和分化为神经元样细胞的实验研究

朱晓瓞1， 余资江1， 孙宝飞1， 余 彦1， 李玉美1， 罗时鹏1， 肖朝伦2， 贺菊芳1

目的 体外分离和扩增小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，并观察不同方法诱导BMSCs向神经元样细胞分化的差异，以寻找一种效果理想的BMSCs体外诱导方法。方法 取昆明小鼠双股骨骨髓，采用全骨髓贴壁法体外纯化扩增BMSCs，流式细胞术检测其表面标志物，并对其进行成脂、成骨诱导鉴定。分别用化学诱导法和共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞，比较两种方法所获得的神经元样细胞的细胞形态。结果 采用全骨髓贴壁法能有效分离小鼠BMSCs，随着传代次数的增加能得到逐渐纯化的BMSCs，而过多的传代次数则出现细胞生长速度缓慢、核固缩、脱离等衰老征象。流式细胞术检测结果显示P4代BMSCs阳性表达CD29和Sca-1，而阴性表达CD11b。具有成脂、成骨诱导分化的能力。共培养法诱导第5天可见神经细胞样形态且细胞突起数量较多并有分支；化学诱导法培养第7天细胞出现较长突起，形成神经样结构。结论 采用全骨髓贴壁法能有效分离纯化小鼠BMSCs，通过共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞效果优于化学诱导法。

小鼠； 骨髓间充质干细胞； 扩增； 分化； 神经元样细胞

长期以来，由于神经元再生能力差，细胞受损后很难重建树突和轴突之间的联系，神经系统疾病的治疗是临床上棘手的问题[1]。因此，寻找神经元细胞的有效移植物对于神经科学领域的发展具有重要意义。近年来， BMSCs作为理想的生物工程种子细胞因其具有多向分化潜能而备受关注，多项研究证实BMSCs在体外特定的诱导条件下，可分化为神经元样细胞，并且具有取材方便、连续传代培养或冷冻保存后依然保留生物学特征、组织修复能力强、抗原性小等特征，为脑组织损伤等神经系统疾病的治疗提供一种新思路[2]。目前，诱导BMSCs向神经元样细胞分化的方法较多，主要包括抗氧化剂等化学诱导法，生长因子和改变BMSCs所处微环境共培养法和分步诱导、慢病毒转染的方法[3～5]。本研究通过体外分离纯化扩增小鼠骨髓间充质干细胞，并采用两种诱导法对小鼠BMSCs分化为神经元样细胞进行实验研究，旨在为临床神经再生应用提供一种高效、安全的诱导方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性昆明种小鼠10只，4周龄，体重(20±2)g，购自贵州医科大学实验动物中心[合格证号：SCXK(黔)(2012-0004)]。

1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12培养基、D-Hanks缓冲液购自HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自GIBCO公司，谷氨酰胺(L-Glutamine)、胰岛素、3-异丁基-1甲基黄嘌呤(IBMX)、罗格列酮、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、油红O染液、茜素红染液购自Cyagen公司，FITC anti-mouse/rat CD29、PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)、APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b抗体购自Biolegend公司，PBS干粉、β-巯基乙醇、丁羟基茴香醚(BHA)购自Sigma公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA购自HyClone公司，37 ℃恒温培养箱购自LEAD-Tech公司；37×B倒置相差显微镜购于上海光学仪器六厂。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BMSCs分离培养[6]4周龄小鼠颈椎脱臼处死后，75%酒精全身浸泡消毒10 min，于无菌条件下取出双侧股骨及胫骨，尽量去除骨表面结缔组织及表面血污，置于含有D-Hanks缓冲液的培养皿中，于酒精灯火焰周围移入超净工作台。用D-Hanks缓冲液洗涤两次后，眼科剪小心剪断双侧股骨头，用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基(含100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素)从股骨一端反复冲洗，另一端收集冲出的骨髓悬液。均匀混合后，用1 ml注射器反复抽吸制成单细胞悬液。以1000 r/min离心5 min，弃上清。加入完全培养基重悬后调整细胞密度为106/ml接种于25 cm2培养瓶中。将培养瓶置于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养。接种后24 h后，进行首次换液，去掉未贴壁的悬浮细胞，留下贴壁的BMSCs继续培养。之后每隔 2～3 d换液一次，每日用相差倒置显微镜观察细胞形态和生长状况。当贴壁细胞超过85%时弃去培养基，D-Hanks缓冲液轻轻冲洗两次。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化至镜下观察到大部分细胞突起回缩变圆、细胞间隙变大时，加入等体积DMEM/F12完全培养基终止消化。用吸管吹打，使细胞从瓶壁上脱落并分散，收集细胞悬液，以1000 r/min的转速离心5 min。离心结束后，弃上清，D-Hanks重悬细胞沉淀，重复上述离心操作以尽可能洗去残留的胰蛋白酶。DMEM/F12完全培养基重悬后，按1∶2比例传代，倒置相差显微镜下观察传代细胞不同生长时期细胞的生长情况及形态变化。

1.2.2 小鼠不同传代BMSCs的生长曲线测定 取体外扩增第3、5、7代BMSCs按3×104/ml接种于24孔板内，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天取2孔细胞进行计数，计算均值，并以细胞生长时间为横坐标，以细胞数为纵坐标绘制生长曲线。

1.2.3 流式细胞术鉴定小鼠BMSCs的细胞表面标记物 取体外扩增P4代BMSCs细胞，胰酶-EDTA消化后，PBS洗涤两次，以1000 r/min离心5 min收集细胞，将细胞浓度调整为1×106/ml，分装于试管中(200 μl/管)，每管分别加入抗鼠CD29、Sca-1、CD11b抗体(设不加抗体的阴性对照组)，室温避光孵育20 min，PBS洗涤，离心收集细胞，PBS重悬并上流式细胞仪检测。

1.2.4 BMSCs成骨诱导 诱导分化：取80%～90%融合的P4代BMSCs细胞，以胰酶-EDTA消化，调整细胞密度为2×104/ml接种于预先包被0.1%明胶的六孔板中，加完全培养基培养至细胞融合达60%～70%时，吸弃完全培养基，每孔加入2 ml成骨诱导分化培养基(每100 ml诱导培养基含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素、L-Glutamine 1 ml、抗坏血酸200 μl、β-甘油磷酸钠1 ml、地塞米松10 μl)，每隔3 d换液一次，每日以倒置相差显微镜观察诱导细胞生长情况及形态变化。鉴定：诱导21 d后吸弃六孔板内的培养基，PBS冲洗两次，每孔加入2 ml 4%中性甲醛溶液，固定30 min，PBS冲洗两次，每孔加入1 ml 茜素红染液染色3～5 min，PBS冲洗两次，倒置相差显微镜下观察染色结果。

1.2.5 BMSCs成脂诱导 诱导分化：取80%～90%融合的P4代BMSCs细胞，以胰酶-EDTA消化，调整细胞密度为2×104/ml接种于六孔板中，加完全培养基培养至细胞过融合时，吸弃完全培养基，换用成脂诱导分化培养基A (每100 ml诱导培养基中含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素、谷氨酰胺1 ml、胰岛素200 μl、IBMX 100 μl、罗格列酮100 μl、地塞米松100 μl)2 ml/孔诱导3 d后，换用成脂诱导分化培养基B(每100 ml诱导培养基中含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素、谷氨酰胺1 ml、胰岛素200 μl)2 ml/孔诱导24 h后，再换回成脂诱导分化培养基A进行诱导，A液和B液交替诱导3次后，继续用B液维持培养4 d，每2 d换液一次，诱导期间每日以倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长情况。鉴定：成脂诱导结束后，PBS冲洗两次，每孔加入2 ml 4%中性甲醛溶液，固定30 min，PBS冲洗两次，每孔加入1 ml油红O染料工作液染色30 min，PBS冲洗3次，镜下观察染色情况。

1.2.6 BMSCs诱导分化为神经元样细胞。

1.2.6.1 共培养诱导分化[7]取小鼠大脑组织，于低糖型DMEM培养液中将皮质剪成小块，用2 ml注射器芯杆碾压过40 μm滤网，收集滤液，用培养基洗涤3次，将细胞浓度调整为1×103/ml，并接种于6孔板内，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，进行首次换液，去除未贴壁细胞，之后每隔2～3 d换液一次，第6天可见典型神经细胞结构。取培养好的神经细胞，胰酶消化后收集细胞，将细胞浓度调整为1×106/ml，接种于Transwell培养皿底层。取体外扩增P4代BMSCs细胞，胰酶消化后收集细胞，将细胞浓度调整为1×105/ml，接种于Transwell培养皿的insert内，培养液为低糖型DMEM(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素)，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，对照组insert内及Transwell培养皿底层均接种BMSCs。

1.2.6.2 化学诱导分化[8]取体外扩增P4代BMSCs细胞，胰酶-EDTA消化后收集细胞，将细胞浓度调整为1×105/ml，接种于24孔板生长达到60%～70%融合时，用含3 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM/F12(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素)预诱导24 h，PBS洗涤3次，然后用含20 g/L DMSO、 200 μmol/L BHA的无血清DMEM/F12培养诱导6 h。对照组为不加诱导剂培养。

2 结 果

2.1 小鼠BMSCs的培养 接种时BMSCs呈圆形，形态不一，细胞核不清晰，悬浮状，混有较多血细胞(见图1中图A1)。接种后数小时开始有细胞贴壁生长，24 h首次换液，弃去大量漂浮的血细胞后，可观察到大部分细胞贴壁，36 h即可见到少数细胞出现形态变化(见图1中图A2)。起初生长较慢，大小、形态不一，可成卵圆形、三角形、菱形，但以扁平梭形为主，胞核卵圆形，可见一些微克隆。5～7 d细胞生长较快，不断分裂增殖出现集落样细胞，随着时间的增加，细胞突起变长，形态逐渐趋于一致，但仍可见较多非BMSCs的杂细胞混于其中(见图1中图A3、A4)。11 ～ 14 d细胞克隆减慢，出现70%～80%融合，在融合部位可见“漂浮团”样克隆的小圆形细胞。传代细胞于接种后1 h已见部分细胞贴壁，6 h基本全部贴壁生长，形状为扁平的长梭形，传至P4代细胞，细胞纯化度较高，可见细胞排列较有序，呈水纹状分布，具有一定的极性(见图1中图B1～B4)。

2.2 小鼠BMSCs生长曲线 生长曲线结果显示，小鼠BMSCs的生长存在潜伏期、生长对数期和平台期，前3 d为潜伏期，第3天开始迅速增至，进入生长对数期，第8天开始生长速度减慢进入平台期，且随着传代次数的增加，细胞增殖的速率有所下降(见图2)。说明小鼠BMSCs具有一定的增生分裂能力。此外，随着传代次数的不断增加，小鼠BMSCs的增殖能力逐渐发生退化。

2.3 小鼠BMSCs的细胞表面标志物表达 流式细胞仪检测结果显示，生长良好的P4代BMSCs细胞的粘附分子CD29和干细胞表面标记Sca-1与阴性对照组相比表达明显增加，为阳性表达(见图3中图A1、A2和图B1、B2)；而血细胞表面标记物CD11b为阴性表达(见图3中图C1、C2)。

2.4 小鼠BMSCs成骨、成脂诱导分化结果 成骨诱导：镜下可见接种于六孔板中的BMSCs迅速增殖，约5 d即达到70%融合，形态以长梭形为主，紧密排列，具有一定的极性。开始成骨诱导后，细胞开始逐渐发生形态上的变化，由梭形变为不规则形，以多角形、类圆形、方形为主，无明显排列规则，随着诱导时间的增加逐渐形成群落生长，并出现多层网状结构(见图4中图A1、A2)。诱导分化第21天，以茜素红染色后可见成片橘红色，局部颜色加深形成不透光的钙结节(见图4中图A3)。成脂诱导：倒置显微镜可见六孔板中BMSCs约6 d达到过融合，以成脂诱导分化培养基A进行诱导后，细胞由原来的长梭形逐渐变形为圆形或类圆形，排列紧密，A液和B液交替作用两次后即可见少量细胞内出现较多圆形、透光度高的脂滴，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增多变大(见图4中图B1、B2)。于诱导第16天进行油红O染色，可见胞内脂滴被染为红色(见图4中图B3)。

2.5 小鼠BMSCs分化为神经元样细胞结果 共培养法：培养48 h后即可见BMSCs由长梭形逐渐收缩变小，出现圆形胞体和细长突起，并且发出分支。在培养4～5 d时，细胞形态变成星状，呈放射状生长，并且相互之间连接在一起，形成神经细胞样形态(见图5A)。化学诱导法：在培养3～4 d时BMSCs由长梭形逐渐收缩变小，变成圆形或多边形。培养6～7 d细胞形成较长突起，相互延伸，形成神经样结构(见图5B)。

图1 BMSCs原代培养第0天(A1)×250；BMSCs原代培养36 h(A2)×250；BMSCs原代培养第6天(A3)×250；BMSCs原代培养第6天(A4)×400；P4代BMSCs第0天(B1)×250；P4代BMSCs第2天(B2)×250；P4代BMSCs第8天(B3)×250；P4代BMSCs第8天(B4)×400

图2 小鼠BMSCs P3、P5、P7传代培养生长曲线

图3 阴性对照组FITC anti-mouse/rat CD29表达流式结果(A1)；实验组FITC anti-mouse/rat CD29表达流式结果(A2)；阴性对照组PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)表达流式结果(B1)；实验组PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)表达流式结果(B2)；阴性对照组APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b表达流式结果(C1)；实验组APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b表达流式结果(C2)

图4 成骨诱导分化第11天(A1)×250；成骨诱导分化第21天(A2)×400；茜素红染色(A3)×400；成脂诱导分化第8天(B1)×400；成脂诱导分化第15天(B2)×400；油红O染色(B3)×400

图5 共培养法诱导小鼠BMSCs分化为神经元样细胞的形态观察(A)；化学诱导法诱导小鼠BMSCs分化为神经元样细胞的形态观察(B)×250

3 讨 论

随着神经元细胞的有效移植物-神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的发现，神经元细胞不可再生难题的解决开启了一扇希望之门[9，10]。然而，由于神经干细胞不易获取，通过胚胎移植又涉及医学伦理问题，导致神经干细胞很难在临床中开展应用。BMSCs作为细胞替代治疗中理想的种子细胞，具有多向分化潜能，近年来大量学者通过移植BMSCs分化的神经元样细胞治疗缺血性卒中大鼠，取得良好疗效。Heo[11]成功将骨髓间充质干细胞诱导成神经干细胞，并将其用于治疗缺血性卒中大鼠，结果显示大鼠的神经功能得到有效恢复。Tsai等[12]学者研究也证实骨髓间充质干细胞通过特定环境分化形成神经元样细胞，从而具有治疗缺血性卒中的潜力。这些研究为BMSCs自体移植治疗神经系统疾病提供强有力的理论支持，因此，有效分离BMSCs并将其分化为纯度高且稳定的神经元样细胞是目前研究的重点。

目前，分离BMSCs的方法有多种，本研究中采用全骨髓贴壁法对小鼠BMSCs进行分离的方法是上世纪70年代由美国学者Friedenstein建立的。它利用BMSCs贴壁生长的特性，在培养过程中通过更换培养液除去其他未附壁的混杂细胞，最终获得纯度较高的BMSCs，与其他方法相比更简单易行[13]。本次实验中BMSCs贴壁效果良好，经多次换液后有效摆脱了造血干细胞、红细胞等的干扰，培养全程镜下视野清晰，利于观察细胞的形态变化和生长状况。传代细胞的增殖能力持续存在，具有较为稳定的持续分化能力。细胞传至P4代时，培养环境中的杂细胞量低，能看到稳定分裂增殖的BMSCs形态逐渐趋于一致，排列较原代细胞更为紧密有序，且呈现出一定的漩涡形排列，已经具有了一定的极性，细胞纯度较理想。此外，生长曲线结果显示BMSCs体外培养时存在潜伏期、生长对数期和平台期，且随着传代次数的增加出现细胞生长速度缓慢、核固缩、脱离等衰老征象，这种现象与其他学者对BMSCs传代培养的结局相似[14,15]。同时细胞流式细胞术检测结果显示，P4代BMSCs的表面标志物粘附分子CD29和干细胞表面标志物Sca-1阳性表达，而血细胞表面标志物CD11b阴性表达，这一检测结果说明此法分离提取出的能够稳定自我增殖的细胞是具备有成体干细胞应该具备的特性的。而经成骨和成脂诱导鉴定均表现出良好的向骨细胞和脂肪细胞分化的能力，说明BMSCs具有一定多向分化的潜能。综上，全骨髓贴壁法能够成功分离提取出具有稳定自我增殖能力和多项分化潜能的BMSCs，且在一定范围内随着传代次数的增加，能够得到纯度较高的BMSCs。

作为目前研究较为成熟的一类成体干细胞BMSCs来说，其多向分化的潜能已经被用于临床多邻域疾病的治疗当中。其中也包括了脊髓损伤、脑卒中、外周神经损伤等涉及到神经功能修复与保护的相关疾病。关于BMSCs向神经细胞分化潜能的报导不在少数，方法也多种多样。

化学诱导法的作用机制可能是由于化学试剂产生细胞毒性使细胞的结构产生变化，最终诱导BMSCs分化为神经元样细胞，并且化学试剂有助于维持分化后神经细胞的生存状态[16,17]。本研究中，先采用β-巯基乙醇启动BMSCs向神经元样细胞分化，然后加入抗氧化剂-BHA使BMSCs从氧化状态中释放出来，加速分化的过程。最终可以利用化学诱导途径得到在形态结构上与神经元类似的诱导细胞。而共培养法可能是通过共培养细胞特定的空间结构和分泌细胞因子、神经递质等调控促进BMSCs分化为神经元样细胞[18,19]。单独或联合细胞因子诱导方法的作用机理有部分与之异曲同工。目前已报道的涉及此共培养实验的细胞主要有嗅鞘细胞[20]和神经细胞。本研究我们在共培养法中使BMSCs置于更贴近体内神经系统的微环境，并尽可能保持细胞间相互联系，促进BMSCs有效分化为神经元样细胞。最终实验结果表明，两种诱导方法均能成功促进BMSCs分化为神经元样细胞，且使用共培养法诱导分化的神经元样细胞所需的时间较化学诱导法更短、神经突样突起数量多且相互间形成一定连接，提示共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞的效果优于化学诱导法。这一实验结论与徐丽丽等[21]的研究结果相一致。然而诱导细胞是否具有真正的神经细胞活性，还需进行后续实验，就神经电生理活性、特异性蛋白表达情况、神经功能等方面加以验证。

[1]张宝华,仇福成,董 慈,等.脑脊液途径移植神经干细胞治疗中枢神经系统疾病的研究现状[J].中国组织工程研究,2014,18(6):974-978.

[2]Crane JL,Xu C.Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling[J].Journal of Clinical Investigation,2014,124(2):466-472.

[3]Zhang J,Li ZG,Si YM,et al.The difference on the osteogenic differentiation between periodontal ligament stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells under inflammatory microenviroments[J].Differentiation,2014,88(4-5):97-105.

[4]Bae KS,Park JB,Kim HS,et al.Neuron-like differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Yonsei Medical Journal,2011,52(3):401-412.

[5]Zeng R,Wang LW,Hu ZB,et al.Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro[J].Spine,2011,36(13):997-1005.

[6]Cai Y.Comparisons of mouse mesenchymal stem cells in primary adherent culture of compact bone fragments and whole bone marrow[J].Stem Cell International,2015,2015(3):180-181.

[7]Chen ZS,Chu Q,Liu YF,et al.Induction ways of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into nerve cells[J] .Chinese Journal of Tissue Engineering Research,2013,17(32):5757-5764.

[8]Zhao Lei,Lin Yongda,Ma J,et al.Culture and neural differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro[J].Cell Biology International,2007,31(9):916-923.

[9]Akamatsu W,Okano H.Neural stem cell,as a source of graft material for transplantation in neuronal disease[J].No to Hattatsu Brain & Development,2001,33(2):114-120.

[10]高 谋,徐如祥,杨志军,等.两种神经干细胞移植方法对宿主脑损伤和移植物维系的影响[J].中华神经医学杂志,2015,14(4):175-178.

[11]Heo JS,Choi SM,Kim HO,et al.Neural transdifferentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells on hydrophobic polymer-modified surface and therapeutic effects in an animal model of ischemic stroke[J].Neuroscience,2013,238(26):305-318.

[12]Tsai MJ,Tsai SK,Hu BR,et al.Recovery of neurological function of ischemic stroke by application of conditioned medium of bone marrow mesenchymal stem cells derived from normal and cerebral ischemia rats[J].Journal of Biomedical Science,2014,21(1):1-12.

[13]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].Experimental Hematology,1976,4(5):267-274.

[14]Li X,Zhang Y,Qi G.Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells[J].Cytotechnology,2013,65(3):323-334.

[15]Zhu X,Yan T,Yao W,et al.Optimization of the method for isolating and culturing rat mesenchymal stem cells[J].Journal of Southern Medical University,2014,34(11):1621-1626.

[16]王卫民,丁 妍.BHA诱导人脐带间充质干细胞分化为神经细胞[J].东南大学学报:医学版,2013,32(2):201-205.

[17]Greene CA,Green CR,Sherwin T.Transdifferentiation of chondrocytes into neuron-like cells induced by neuronal lineage specifying growth factors[J].Cell Biology International,2014,39(2):185-191.

[18]付 苏,石贞玉,范文娟,等.微环境诱导iPSCs和BMSCs向神经元样细胞分化-Reelin对细胞分化和极性化的调节作用[J] .生理学报,2015,4:357-369.

[19]Kalladka D,Muir KW.Brain repair:cell therapy in stroke[J] .Stem Cells & Cloning Advances & Applications,2014,7(1):31-44.

[20]张燕青,曾园山,张 静,等.体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞[J].中国神经精神疾病杂志,2007,33(10):612-614.

[21]徐丽丽,匡 弢,张 佳,等.体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化:两种方法的比较[J].中国组织工程研究,2013,(45):7821-7826.

Mouse bone marrow mesenchymal stem cells expansion and differentiate into neuron-like cells in vitro

ZHU Xiaodie,YU Zijiang,SUN Baofei,et al.

(Human Anatomy Department of Basic Medical College,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China)

Objective To observe the mouse bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) expansion in vitro,and to find a suitable and practical method of inducing BMSCs into neuron-like cells in vitro by comparing chemical induction and co-culture.Methods BMSCs which that were isolated from mice by the all bone marrow adherence method were cultured in the optimum culture condition,and light microscopy and flow cytometry were used to study the morphology and biological characteristics of BMSCs.The potential to differentiate into osteoblasts and adipocytes was confirmed also.BMSCs were cultured by chemical induction and co-culture methods,respectively.Cell morphology were compared.Results The all bone marrow adherence method had effective separation of BMSCs,and they lost their differentiation ability gradually during successive generations.The flow cytometry showed that the CD29 and Sca-1 of the P4 BMSCs were positive expression,and CD11b were negative expression.The BMSCs did have the potential to differentiate into osteoblasts and adipocytes in vitro.Neuron-like cells with a larger number of processes were observed on the 5th day in co-culture group while cells with typical nerve cell structure and processes were found on the 7th day in chemical induction group.Conclusions The all bone marrow adherence method has effective separation of BMSCs.The differentiation effect is better in co-culture group compared with chemical induction group.

Mouse; Bone marrow mesenchymal stem cells; Expansion; Differentiate; Neuron-like cells

1003-2754(2016)10-0868-05

2016-04-16；

2016-09-29

国家自然基金(81060108)，贵州省科技厅2012年社会发展攻关项目[黔科合SY字(2012)3153号]

(1.贵州医科大学基础医学院人体解剖学教研室,贵州 贵阳 550025;2.贵州医科大学基础医学院人体解剖学实验中心，贵州 贵阳 550025)

余资江,E-mail:yzj0112@126.com

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