肿瘤坏死因子-α通过内皮型一氧化氮合酶和小凹蛋白-1介导内皮细胞功能失调的研究

崔源源 王欣 刘剑刚 赵福海 史大卓 综述 陈可冀 审校

(中国中医科学院西苑医院心血管病中心，北京 10009)



肿瘤坏死因子-α通过内皮型一氧化氮合酶和小凹蛋白-1介导内皮细胞功能失调的研究

崔源源 王欣 刘剑刚 赵福海 史大卓 综述 陈可冀 审校

(中国中医科学院西苑医院心血管病中心，北京 10009)

血管内皮细胞功能失调是致动脉粥样硬化形成的重要机制之一。其中，内皮型一氧化氮合酶和小凹蛋白-1是调节脂质物质摄取和炎症细胞跨内皮迁移的重要蛋白。肿瘤坏死因子-α为多效性促炎症反应细胞因子，可通过核因子-κB信号通路下调内皮型一氧化氮合酶表达，上调小凹蛋白-1表达，诱导内皮细胞胞吞转运作用失衡和炎症细胞跨内皮迁移，促使局部血管斑块形成。现就肿瘤坏死因子-α通过核因子-κB信号通路诱导血管内皮功能失调的机制做一简要综述。

肿瘤坏死因子-α；内皮型一氧化氮合酶；小凹蛋白-1；动脉粥样硬化

内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和小凹蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)主要分布在血管内皮细胞、心肌细胞和气管上皮细胞的质膜小凹内，在维持血管正常功能方面具有重要作用。Cav-1与eNOS解离(60～101氨基酸位点或135～178氨基酸位点)，活化的eNOS从小凹内转移至细胞质，经合成分泌一氧化氮(NO)气体信号分子，发挥调节血管紧张度、调控脂质物质摄取、抑制血小板黏附聚集和减少炎性细胞浸润等作用。Cav-1与eNOS结合，可抑制eNOS活化，阻碍NO合成分泌，进而诱导内皮下脂质沉淀和炎症细胞跨内皮转移，促使动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生发展[1-2]。肿瘤坏死因子(TNF)-α为多效性促炎症反应细胞因子，在心血管疾病发病过程中具有重要影响。研究证据表明[3]，TNF-α通过核因子-κB(NF-κB)信号通路减少NO合成分泌，增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生，从而促使动脉粥样硬化性斑块形成。现就TNF-α介导的内皮功能失调的机理做一综述。

1 eNOS/Cav-1的结构和生理功能

小凹为细胞质膜表面的内陷结构，直径50～100 nm，呈烧瓶状，在调节细胞信号传导和物质转运方面具有重要地位。小凹中包含了诸多的结构蛋白和分子，如eNOS和Cav-1等。其中，Cav-1是小凹的标志性结构蛋白之一，呈发簪样结构镶嵌在小凹内，其脚手架结构域在调节信号转导，血液与周围组织之间的物质交换及维持机体稳态方面发挥了关键作用[4]。

eNOS呈同源二聚体结构，经C-末端烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化成NADP+产生电子，这些电子经NADPH转移至另一单体N-末端的血红素铁结合位点，在该位点催化成Fe2+-NO络合物。在四氢生物蝶呤和L-精氨酸参与下，完成NO的合成与分泌，从而发挥血管内皮功能。eNOS的二聚体结构由钙调节蛋白(CaM)维系：一方面，维持eNOS结构稳定性，防止eNOS解偶联；另一方面，活化的CaM可顺利完成电子传递，激活eNOS，发挥eNOS功能。Cav-1主要作用于eNOS的CaM位点，抑制eNOS内部电子传递，使eNOS处于失活状态[2]。

2 TNF-α经NF-κB信号通路影响Cav-1和eNOS表达

TNF-α不仅干扰eNOS合成分泌NO，而且在转录调控水平、翻译和翻译后调控水平方面下调eNOS表达。在转录调控方面，Wang等[5]发现TNF-α引起p38α过表达，显著下调eNOS启动子活性，该反应可被突变型p38α或特异性抑制剂SB203580抑制。在翻译和翻译后调控方面，TNF-α主要作用在eNOS mRNA 3’端非翻译区(3’-UTR)，导致eNOS mRNA不稳定性。Yi等[8]发现，TNF-α刺激后，相对分子质量为57kD(≈5.7×104)的多聚嘧啶区结合蛋白-1特异性地结合在eNOS 3’-UTR，该结合蛋白-1过表达引起人内皮细胞eNOS 3’-UTR活性降低及eNOS表达下降。此外，TNF-α也增加3’-UTR核糖核蛋白复合物形成相对分子质量为52 kD(≈5.2×104)和57 kD(≈5.7×104)，增加翻译延伸因子1-α表达，形成重组谷光氨肽S-转移酶-翻译延伸因子1-α融合蛋白，后者特异性地结合在eNOS mRNA 3’-UTR，增加eNOS mRNA不稳定性，导致eNOS表达下调[9]；另有研究者[10]发现，TNF-α抑制eNOS mRNA和蛋白水平与启动子活性无关，主要是通过降低eNOS mRNA3’-UTR稳定性引起的。TNF-α增加MIR155HG表达，启动子活性和miR-155生物基因，进而诱发eNOS mRNA3’-UTR不稳定性。

NF-κB为二聚体转录因子，在正常情况下潜藏在细胞质，其活性被Ikappa B(IκB)蛋白所抑制。经外界刺激，IκB蛋白被降解，NF-κB快速磷酸化和泛素化，使NF-κB易位至细胞核，入核后，NF-κB以蝶形二聚体结构作用于靶DNA元件，激活免疫、炎症反应和细胞生长调控相关基因的编码蛋白转录，造成不同细胞的基因突变。多项研究发现[11-12]，TNF诱导的eNOS失调与NF-κB通路激活相关。经TNF-α刺激后，血管内皮细胞内白介素-1β分泌增高，NF-κB表达上升，且发生明显的入核转位现象，导致eNOS蛋白水平降低，炎症小体调控基因NRLP3和caspase-1表达增加[13-14]。Lee等[10]研究发现，NF-κB能够降低eNOS mRNA稳定性和3’-UTR活性，下调eNOS蛋白水平，上述反应能够被NF-κB抑制剂和dicer敲除所消除，但并不能被p38MAPK和MEK阻滞剂所阻滞，从而提示TNF-α介导的NF-κB信号通路与eNOS的紧密性。另外，作为eNOS的调节蛋白，HSP90也参与NF-κB信号通路的调节。NF-κB活化主要与TNF-α促进IκB激酶(IKK)复合物形成相关，形成的IKK复合物是诱导IκB磷酸化，降解IκB的主要物质。IKK复合物激活同样需要HSP90参与，诱导IKK/HSP90相互作用，而失去HSP90的eNOS容易发生解偶联，导致NO合成障碍[15]。

TNF-α的大部分生物学效应是通过细胞表面的TNF相关受体(TNFRs，如TNF-R1和TNF-R2)实现的。正常情况下，内皮细胞内TNFRs潜藏在质膜微囊内——脂质筏或小凹内，未见表达。虽然多项研究已证实TNFRs主要激活NF-κB经典信号通路，但是，TNFRs是如何从小凹内转移至细胞质诱导NF-κB信号通路的，尚未清楚。作为下游信号转导分子的接头蛋白，内源性TNF受体相关因子-2(TRAF-2)位于细胞质膜上参与Cav-1/TRAF-2复合物合成。经TNF-α刺激，TRAF-2直接募到TNF-R2区域，或经TNF死亡结构蛋白(TRADD，TNF-R1信号转导蛋白)，间接地募集到TNF-R1区域，引起TNFRs过表达，且重新分布。经TNF-α转换蛋白(TACE)，TNFRs与Cav-1分离，从小凹内分离释放到细胞质，继而，TNFRs相关脚手架蛋白与IKK/TRAF-2复合物相互作用，参与TNF-α诱导的NF-κB信号通路激活，促使内皮细胞发生一系列的病理反应。以上表明TNF-α经上游TNFRs激活NF-κB信号通路，参与内皮细胞功能调节。

3 TNF-α诱导脂质沉淀和炎症反应

Cav-1被称为“促动脉粥样硬化性蛋白”，主要从两个方面体现其对AS形成的作用：一方面，Cav-1诱导内皮胞吞转运作用失调，促使更多的脂质物质聚集在内皮下区域；另一方面，Cav-1增加细胞黏附分子水平，促进炎症细胞浸润至内皮下，最终诱发斑块形成。以上两个方面具有一定的交叉性，加速AS形成。

血管内皮层胞吞转运作用表现为半渗透性将血液中营养物质转运至内皮下，小凹作为转运物质的主要场所和通道，在细胞胞吞转运作用中发挥了重要作用[16]。Fernandez-Hernando等[17]观察Cav-1缺失的ApoE(-/-)小鼠，发现与正常小鼠比较，Cav-1(-/-)小鼠AS发展速度缓慢，动脉血管壁低密度脂蛋白(LDL)渗入减少，白细胞黏附分子降低和NO产量增加，提示内皮细胞内Cav-1在诱导AS的发生发展过程中发挥负性调节作用。Zhang等[18]发现在人脐静脉内皮细胞内，TNF-α显著增加LDL转运，刺激LDL滞留在血管壁内皮层下。进一步研究揭示，TNF-α增加NF-κB和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ转录活性，形成包含NF-κB p65/过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的活性转录因子复合物，刺激促内皮细胞转运的LDL受体和Cav-1表达增加，使得更多的LDL转运至内皮下。机制研究表明[19]，Cav-1表达升高，血管内皮细胞小凹数量增多，进而小凹摄取血清白蛋白的含量上升，说明内皮细胞TNF-α介导的Cav-1胞吞转运作用失调是致AS一个重要环节。

细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等黏附分子属于免疫球蛋白超家族，在生理情况下，这些黏附分子并未表达。在TNF-α刺激下，内皮细胞活化并快速合成ICAM-1、VCAM-1等黏附分子，合成的黏附分子能促进炎性细胞跨内皮迁移，这一过程与NF-κB信号通路介导的Cav-1调节有一定相关性[20]。研究发现[21]，TNF-α调节NF-κB p65表达和IκBα磷酸化，诱导内皮细胞表达ICAM-1。在人内皮细胞内，ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白表达主要由TNF-R1经NF-κB依赖性方式产生，因此，NF-κB信号通路在介导ICAM-1等黏附分子中的重要意义。Engel等[22]将Cav-1(+/+)ApoE(-/-)小鼠病变血管与Cav-1(-/-)ApoE(-/-)小鼠病变血管进行比较，发现后者斑块减少15倍，巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞浸润明显减少，而该结果便是归因于较低的黏附分子表达。

经外界刺激后，小凹正常的小鼠，VCAM-1水平上升，内皮层表面的炎性细胞黏附增多；而在siRNA介导的Cav-1敲除小鼠中，VCAM-1依赖性炎性细胞黏附水平显著降低[23]。ICAM-1和VCAM-1与Cav-1紧密协同小凹/Cav-1介导炎症细胞跨内皮转移[24-25]。经TNF-α刺激，细胞质膜表层的ICAM-1、VCAM-1易位至富有小凹和肌动蛋白(F-肌动蛋白)的质膜域，并被吞入到小凹的基底质膜，在细胞内部融合形成一条通道，而在该通路中可发现淋巴细胞碎片；电镜三维重建技术表明，淋巴细胞所穿过的跨细胞内通路是一种类似精囊-空泡样细胞器，与ICAM-1、F-肌动蛋白和小凹聚集融合成的囊泡形态类似；另外，一些炎性细胞活化后可延伸伪足、滚动、迁移至富含ICAM-1和F-肌动蛋白的小凹区域，诱导炎性细胞迁移[26]。除此之外，TNF-α诱导内皮细胞肌动蛋白骨架(纤维状肌动蛋白，F-肌动蛋白)重新分布，应力纤维形成及紧密连接蛋白排序紊乱、数量减少、细胞裂隙增多，破坏内皮细胞屏障完整性，也促使炎性细胞顺利浸润至内皮下[27]。以上研究表明，TNF-α经INF-κB信号通路上调CAM-1、VCAM-1等黏附分子表达，扰乱内皮细胞eNOS/Cav-1水平，参与脂质物质转胞吞作用失调和炎症细胞跨内皮迁移。

4 总结

血管内皮层作为循环血液和血管壁内皮下组织之间的天然屏障，在调节血管通透性、免疫防御及炎症反应中具有关键性意义。TNF-α诱导NF-κB信号通路，下调eNOS表达，提高Cav-1水平，降低NO合成分泌，导致血管防御功能下降，诱导脂质沉淀及炎症细胞跨内皮转移，引起AS的发生发展。基于以上认识，提示eNOS/Cav-1可能是防治AS的关键效应靶点。

[1] Atochin DN,Huang PL.Endothelial nitric oxide synthase transgenic models of endothelial dysfunction[J].Pflügers Arch,2010,460(6):965-974.

[2] Gielis JF,Lin JY,Wingler K,et al.Pathogenetic role of eNOS uncoupling in cardiopulmonary disorders[J].Free Radic Biol Med,2011,50(7):765-776.

[3] Moe KT,Khairunnisa K,Yin NO,et al.Tumor necrosis factor-α-induced nuclear factor-kappaB activation in human cardiomyocytes is mediated by NADPH oxidase[J].J Physiol Biochem,2014,70(3):769-779.

[4] Pavlides S,Gutierrezpajares JL,Danilo C,et al.Atherosclerosis,caveolae and caveolin-1[M].Caveolins and Caveolae.Springer US,2012:127-144.

[5] Wang B,Xing F,Na L,et al.p38α subtype is a potential target to inhibit eNOS activity and NO production in human endothelial cells[J].Microvasc Res,2014,91:58-65.

[6] Dai Y,Mehta JL,Chen M.Glucagon-like peptide-1 receptor agonist liraglutide inhibits endothelin-1 in endothelial cell by repressing nuclear factor-kappa B activation[J].Cardiovasc Drugs Ther,2013,27(5):371-380.

[7] Lobysheva I,Rath G,Sekkali B,et al.Moderate caveolin-1 downregulation prevents NADPH oxidase-dependent endothelial nitric oxide synthase uncoupling by angiotensin Ⅱ in endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(9):2098-2105.

[8] Yi B,Ozerova M,Zhang GX,et al.Post-transcriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase expression by polypyrimidine tract-binding protein 1[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2015,35(10):2153-2160.

[9] Yan G,You B,Chen SP,et al.Tumor necrosis factor-alpha downregulates endothelial nitric oxide synthase mRNA stability via translation elongation factor 1-alpha 1[J].Circ Res,2008,103(6):591-597.

[10] Lee KS,Kim J,Kwak SN,et al.Functional role of NF-κB in expression of human endothelial nitric oxide synthase[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,448(1):101-107.

[11] Hsu WH,Lee BH,Lu I,et al.Ankaflavin and monascin regulate endothelial adhesion molecules and endothelial NO synthase(eNOS) expression induced by tumor necrosis factor-α (TNF-α) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)[J].J Agric Food Chem,2012,60(7):1666-1672.

[12] Goodwin BL,Pendleton LC,Levy MM,et al.Tumor necrosis factor-alpha reduces argininosuccinate synthase expression and nitric oxide production in aortic endothelial cells[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(2):H1115-H1121.

[13] 赵云,韩秀敏,赵明,等.姜黄素抑制NRLP-3表达对抗肿瘤坏死因子α诱导的人血管内皮细胞炎症[J].中国组织工程研究,2014,18(38):6165-6171.

[14] 沈涛,朱玉萍,阮杨,等.阿魏酸通过抑制核因子κB信号途径降低肿瘤坏死因子α诱导的人血管内皮细胞氧化应激及黏附分子表达[J].中国动脉硬化杂志,2013,21(5):385-390.

[15] Mohan S,Konopinski R,Yan B,et al.High glucose-induced IKK-Hsp-90 interaction contributes to endothelial dysfunction[J].Ajp Cell Physiol,2009,296(1):182-192.

[16] Zhao YL,Song JN,Zhang M.Role of caveolin-1 in the biology of the blood-brain barrier[J].Rev Neurosci,2014,25(2):247-254.

[17] Fernandez-Hernando C,Yu J,Suarez Y,et al.Genetic evidence supporting a critical role of endothelial caveolin-1 during the progression of atherosclerosis[J].Cell Metab,2009,10(1):48-54.

[18] Zhang Y,Yang X,Bian F,et al.TNF-alpha promotes early atherosclerosis by increasing transcytosis of LDL across endothelial cells:crosstalk between NF-kappaB and PPAR-gamma[J].J Mol Cell Cardiol,2014,72:85-94.

[19] Hu G,Schwartz DE,Shajahan AN,et al.Isoflurane,but not sevoflurane,increases transendothelial albumin permeability in the isolated rat lung:role for enhanced phosphorylation of caveolin-1[J].Anesthesiology,2006,104(4):777-785.

[20] Pavlides S,Gutierrez-Pajares JL,Iturrieta J,et al.Endothelial caveolin-1 plays a major role in the development of atherosclerosis[J].Cell Tissue Res,2014,356(1):147-157.

[21] Feng TT,Liang ZY,Chen S.Squamosamide derivative FLZ inhibits TNF-alpha-induced ICAM-1 expression via down-regulation of the NF-kappaB signaling pathway in ARPE-19 cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(8):9126-9132.

[22] Engel D,Beckers L,Wijnands E,et al.Caveolin-1 deficiency decreases atherosclerosis by hampering leukocyte influx into the arterial wall and generating a regulatory T-cell response[J].FASEB J,2011,25(11):3838-3848.

[23] Han SG,Eum SY,Toborek M,et al.Polychlorinated biphenyl-induced VCAM-1expression is attenuated in aortic endothelial cells isolated from caveolin-1 deficient mice[J].Toxicol Appl Pharmacol,2010,246(1-2):74-82.

[24] Fu C,He J,Li C,et al.Cholesterol increases adhesion of monocytes to endothelium by moving adhesion molecules out of caveolae[J].Biochim Biophys Acta,2010,1801(7):702-710.

[25] Wu H,Deng R,Chen X,et al.Caveolin-1 is critical for lymphocyte trafficking into central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Neurosci,2016,36(19):5193-5199.

[26] Gorbunov NV,Atkins JL,Gurusamy N,et al.Iron-induced remodeling in cultured rat pulmonary artery endothelial cells[J].Biometals,2012,25(1):203-217.

[27] Lee SY,Zaske AM,Novellino T,et al.Probing the mechanical properties of TNF-α stimulated endothelial cell with atomic force microscopy[J].Int J Nanomed,2011,6(6):179-195.

TNF-α Modulates Endothelium Dysfunction via eNOS/Caveolin-1

CUI Yuanyuan,WANG Xin,LIU Jiangang,ZHAO Fuhai,SHI Dazhuo,CHEN Keji

(HeartInstituteofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China)

Endothelium dysfunction plays an crucial role in the development of atherosclerosis.Endothelial nitric oxide synthase(eNOS) and caveolin-1 are important proteins in modulating lipids uptake and inflammatory cell tranendothelial migration.Tumor nuclear factor-α as pleiotropic proinflammatory cytokine，mediates eNOS and caveolin-1 expression，elicits endothelium dysfunction via nuclear factor-κB signaling pathway.Here we describe the detailed mechanisms of tumor nuclear factor-α modulated endothlium dysfunction via nuclear factor-κB pathway.

Tumor nuclear factor-α;Endothelial nitric oxide synthase;Caveolin-1;Atherosclerosis

崔源源(1986—)，博士研究生，主要从事冠心病等研究。Email：cuiyuanyuan59@yeah.net

赵福海(1968—)，主任医师，博士，主要从事介入研究。Email：xahappysea@aliyun.com

R972+.6

A 【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2016.06.011

2015-12-31

2016-05-06