大豆蛋白-壳寡糖聚合物的酶促合成及凝胶性质

王 丹， 姜 淑 娟， 妥 彦 峰， 钱 方， 牟 光 庆,2

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034； 2.东北农业大学 食品安全与营养协同创新中心， 黑龙江 哈尔滨 150030 )



大豆蛋白-壳寡糖聚合物的酶促合成及凝胶性质

王 丹1， 姜 淑 娟1， 妥 彦 峰1， 钱 方1， 牟 光 庆1,2

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034； 2.东北农业大学 食品安全与营养协同创新中心， 黑龙江 哈尔滨 150030 )

采用转谷氨酰胺酶促反应合成大豆蛋白-壳寡糖聚合物，并对大豆蛋白-壳寡糖聚合物进行凝胶性质与微观结构分析。结果表明，酶促反应最适条件为：反应温度37 ℃，酶添加量10 U/g，糖与蛋白质量比0.8，蛋白质量浓度6 mg/mL，反应时间3 h。在此条件下，酶促合成聚合物的接枝率为57.49%；制备聚合物的热致凝胶硬度、弹性与蛋白凝胶基本相同，但其酸化凝胶的硬度、弹性、保水性明显高于大豆蛋白酸凝胶。

大豆蛋白；壳寡糖；聚合物；凝胶性质

0 引 言

大豆蛋白是含量最为丰富的优质植物蛋白质，广泛应用于食品中。对大豆蛋白进行酶法修饰可能改善蛋白功能性质，并减少其他方法带来的营养损失、有毒物质等[1]。壳寡糖是自然界中唯一带有正电荷阳离子碱性氨基多糖，含有亲水性羟基与可反应氨基，具有广泛的生物学功能特性[2]。在壳寡糖存在条件下，利用转谷氨酰胺酶催化转酰基反应修饰大豆蛋白，形成大豆蛋白-壳寡糖聚合物，可能改善大豆蛋白的凝胶性质、保水性等。

骆辉等[3]应用转谷氨酰胺酶催化壳聚糖与明胶的酶促聚合并对其进行表征，发现溶菌酶可使其降解。黄文秀等[4]应用酪蛋白非磷酸肽对大豆蛋白进行修饰，结果发现表面疏水性是影响二者结合的关键因素，控制蛋白表面疏水性，以期促进最大化的正向聚合。Song等[5]对大豆蛋白与壳寡糖的结合状况进行研究，结果发现其表面疏水性与乳化性低于大豆蛋白，其乳化稳定性明显高于大豆蛋白。本实验在壳寡糖存在条件下，利用转谷氨酰胺酶催化对大豆蛋白进行修饰研究，优化酶促反应条件。通过测定大豆蛋白-壳寡糖聚合物凝胶性质，分析评价聚合物凝胶性质。

1 材料与方法

1.1 材 料

大豆蛋白，山东嘉华保健品股份有限公司；壳寡糖，浙江金壳药业有限公司；转谷氨酰胺酶，泰兴市一鸣生物制品有限公司。

SKD-200凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司；TA-XT plus物性测试仪，Stable Mico System；JSM-6460LV型扫描电子显微镜。

1.2 方 法

1.2.1 大豆蛋白-壳寡糖聚合物制备

将大豆蛋白溶液与壳寡糖溶液按照等体积混合均匀后，立即加入TGase酶液，酶添加量为10 U/g 蛋白质[6]，混合均匀，在37 ℃水浴振荡反应一定时间后，收集生成的沉淀，并用蒸馏水反复清洗沉淀，收集沉淀冻干得大豆蛋白-壳寡糖聚合物。在相同条件下，以大豆蛋白溶液、大豆蛋白与壳寡糖混合溶液作为对照组。

1.2.2 聚合物制备条件优化

采用单因素实验研究反应条件对聚合物接枝率的影响。实验条件：糖和蛋白质量比分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4；蛋白质量浓度分别为4、5、6、7、8、10 mg/mL；反应时间分别为1、2、3、4、5 h，考察各条件对大豆蛋白-壳寡糖聚合物接枝率的影响[7]。

1.2.3 聚合物凝胶制备

热致凝胶制备过程[8]：分别称取单一大豆蛋白及聚合物，配制成蛋白质量分数为8%的溶液。90 ℃加热30 min，取出放置室温冷却形成凝胶，测定凝胶强度。

酸化凝胶制备过程[9]：分别称取单一大豆蛋白及聚合物，配制成蛋白质量分数为5%的溶液。按照1 g蛋白加入0.3 g葡萄糖酸-δ-内酯，搅拌均匀，室温放置至形成凝胶后，置于室温保存，测定凝胶强度。

1.2.4 酶活测定

应用ELISA试剂盒测定转谷氨酰胺酶酶活，ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定转谷氨酰胺酶水平，应用试剂盒中标准品绘制标准曲线。

1.2.5 聚合物接枝率测定

采用凯氏定氮法[10]测定大豆蛋白-壳寡糖聚合物的含氮量来确定接枝率。大豆蛋白含氮量为11.86%，壳寡糖含氮量为6.97%。

接枝率计算公式[3]：

接枝率=m1/m0×100%

式中：m0为聚合物中大豆蛋白质量，g；m1为聚合物中壳聚糖质量，g。

1.2.6 聚合物溶解度测定

蛋白质溶解性采用氮溶解指数(NSI)表示[11]。采用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量[12]。根据上清液中蛋白质含量和溶液中蛋白质含量计算NSI(%)。

1.2.7 凝胶性质的测定

凝胶质构测定：使用新型物性测试仪。凝胶强度测试条件[13]：测试前速5 mm/s，测试速度2 mm/s，测试后速5 mm/s，测试距离为8 mm，使用P 0.5圆柱状平头探头，测定凝胶硬度、弹性、黏性，重复3次取平均值。硬度以探头下压过程中的最大感应力(g)表示。

凝胶保水性测定：依据离心法测定聚合物凝胶保水性[14]。

微观结构：将蛋白与壳寡糖混合溶液以及聚合物溶液涂片自然晾干，凝胶样品依据戊二醛固定方法处理[15]，进行扫描电镜分析。

2 结果与讨论

2.1 制备条件的优化

不同反应条件对大豆蛋白壳聚糖聚合物接枝率的影响如图1～3所示。如图1、2所示，在不同质量比及不同蛋白浓度下聚合物接枝率皆呈现先增大后逐渐减小的趋势。可能是因为其中一种底物含量的增加，提高了蛋白质与壳寡糖之间接触机会,使得反应向有利方向进行,从而提高了聚合物接枝率。当质量比或蛋白质浓度增加，一种反应物浓度增加到一定程度，反应已达到饱和,聚合反应不再进行,而使得聚合物接枝率降低。

如图3所示，在不同反应时间下，接枝率随时间的延长呈先增大后不变的趋势，可能由于当反应物质量比及蛋白质量浓度一定时，随着反应时间增加，聚合物接枝反应不再继续。当反应到一定程度，溶液中底物已反应完全，聚合物接枝率在达到一定程度后不再增大[16]。结果表明，聚合反应适宜条件为温度37 ℃，酶添加量10 U/g,壳寡糖与蛋白质量比0.8，蛋白质量浓度6 mg/mL，反应时间3 h。在此条件下制备聚合物，其接枝率为57.49%。

图1 糖与蛋白质量比对聚合物接枝率的影响

图2 蛋白质量浓度对聚合物接枝率的影响

图3 反应时间对聚合物接枝率的影响

2.2 溶解性

大豆蛋白-壳寡糖聚合物的溶解度随pH变化如图4所示。与大豆蛋白相比，聚合物溶解度在pH 4.6～5.5有较明显地提高。在其他pH下都显著降低，并且聚合物的等电点向酸性方向偏移，这可能是因为壳寡糖的引入改变蛋白分子的电荷分布，聚合物在等电点处的溶解性与大豆蛋白相比，变化不显著。

图4 pH对大豆蛋白及其聚合物溶解性的影响

2.3 凝胶性质

由表1可知，热致凝胶中聚合物凝胶黏性明显低于大豆蛋白，凝胶硬度、弹性、保水性与蛋白凝胶无显著差异。酸化凝胶中聚合物硬度、弹性、保水性明显高于大豆蛋白，而黏性显著低于大豆蛋白。这可能由于聚合物与大豆蛋白结构不同，且二者凝胶机理不同导致的。

表1 大豆蛋白及其聚合物的凝胶性质对比

2.4 微观结构

蛋白质的结构反映了蛋白质分子的状态，对蛋白质功能特性起着重要的作用。将大豆蛋白与壳寡糖混合物及聚合物溶液在空气中自然晾干后，用扫描电镜观察它们的结构特征。 如图5所示，大豆蛋白与壳寡糖反应后，聚合物其表面结构发生显著变化，与混合物相比，聚合物结构呈现不规则交联片状，大豆蛋白球形状态消失。蛋白酸化凝胶无片层状结构，表面呈现凹凸不平、有较少网孔结构，而聚合物酸化凝胶有较小球状连接在一起，结构紧密，呈现不规则状。可能由于凝胶形成机理不同，导致电镜观察凝胶结构明显不同。

图5 电子扫描显微镜图谱

3 结 论

转谷氨酰胺酶交联大豆蛋白-壳寡糖聚合物适宜条件为：糖与蛋白质量比0.8、大豆蛋白质量浓度6 mg/mL、反应时间3 h，聚合物接枝率达到最大57.49%。聚合物溶解性在部分pH范围内低于大豆蛋白。热致凝胶中聚合物凝胶硬度、弹性与蛋白凝胶基本无明显差异；酸化凝胶中聚合物凝胶的硬度、弹性、保水性明显高于大豆蛋白胶。微观结构观察表明聚合物形成结实紧密的酸凝胶。

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Enzymatic preparation of soybean protein-oligochitosan polymer and its gel properties

WANG Dan1, JIANG Shujuan1, TUO Yanfeng1, QIAN Fang1, MU Guangqing1,2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China； 2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China )

Transglutaminase (TGase) was used to prepare soybean protein-oligosaccharide polymer, and its gel properties were studied. The result showed that the optimum reaction condition was protein concentration of 6 mg/mL, oligochitosan and protein in the mass ratio of 0.8, TGase addition of 10 U/g at 37 ℃ in 3 h. Under the condition, the graft degree of protein-oligochitosan polymer could reach to 57.49%. The polymers had little change in the hardness and elasticity of heat-induced gel compared with unmodified protein; but the hardness, elasticity and water holding capacity of its acidified gel were significantly higher than that of soybean protein.

soybean protein; oligochitosan; polymer; gel properties

2015-03-13.

国家自然科学基金资助项目(31501513)；国家“十二五”科技支撑计划项目(2013BAD18B04)；辽宁省科学计划项目(2013229027).

王 丹(1989-)，女，硕士研究生；通信作者：姜淑娟(1981-)，女，讲师.

TS201.7

A

1674-1404(2016)06-0391-04

WANG Dan, JIANG Shujuan, TUO Yanfeng, QIAN Fang, MU Guangqing. Enzymatic preparation of soybean protein-oligochitosan polymer and its gel properties[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(6): 391-394.