CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及应用研究进展

孙玉章，孙明军，代永联，尹仁福，丁　壮（. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛　660；. 青岛市畜牧兽医研究所，山东青岛　6600；. 吉林大学动物医学学院，吉林长春　006）

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及应用研究进展

孙玉章1，孙明军1，代永联2，尹仁福3，丁壮3
（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；2. 青岛市畜牧兽医研究所，山东青岛266100；3. 吉林大学动物医学学院，吉林长春130062）

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR / CRISPR-associated nuclease system，CRISPR/Cas）是广泛存在于细菌和古细菌的适应性免疫系统，其中由Ⅱ型CRISPR/Cas系统改造而来的第三代基因组编辑技术——CRISPR/Cas9系统已广泛应用于生命科学研究的多个领域。本文主要从CRISPR/Cas9系统的发现、作用原理、应用进展及与其他新兴的基因组编辑技术的对比等四个方面进行阐述，重点介绍其最新研究进展，并展望了CRISPR/Cas9系统的应用前景。

CRISPR/Cas9；基因组编辑；应用进展

基因组编辑技术（Genome Editing）是通过人为改变基因特定位点的核苷酸序列，实现针对基因组中特定目的基因片段的插入、删除、替换或修饰的新兴分子生物学技术。该技术是通过在目的基因特定位点切割产生DNA的双链断裂（DNA double strand breaks，DSBs），进而诱发机体固有的同源重组（Homology directed recombination repair，HR）和非同源末端连接（Non-homologous endingjoining，NHEJ）两种自我修复机制，从而实现对基因组的定点编辑[1]。

传统的基因组编辑技术主要依赖机体自发的同源重组修复机制来实现对目的基因的定点敲除、替换或修饰，效率极低（10-6～10-9），应用受限。近二十年来兴起的人工核酸内切酶（Engineered endonuclease，EEN）极大地改变了这一现状。目前常用的EEN有四类：归巢核酸内切酶（Meganucleases/LAGLIDADG homing endonucleases，LHE）， 锌 指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs），类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator like effector nucleases，TALENs）和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR / CRISPR-associated nuclease system，CRISPR/Cas）。其中CRISPR/Cas系统是2013年以来发展起来的第三代基因编辑技术，融合了经典遗传学和反向遗传学（Reverse Genetics）的研究方法，以其设计简单、效率高、重复性好和周期短等特点迅速成为一种应用前景广阔的基因组编辑工具。本文仅对这一技术的发展、作用机理及其应用进展等方面的内容进行简述。

1　CRISPR/Cas系统的发现和分类

CRISPR/Cas是一种广泛存在于古细菌和细菌基因组中的适应性免疫系统，其序列特征最先由日本学者于1987年发现。但直到2008年，该系统才被证明可以类似于真核细胞中RNA干扰（RNA interference，RNAi）的方式抵御外源微生物或质粒的入侵。

根据系统发育及作用的分子机制，CRISPR/Cas系统可分为3个类型（Ⅰ型、Ⅱ型与Ⅲ型）[2]：Ⅰ型系统在细菌和古细菌中都有发现，其核心蛋白为具有DNA核酸酶和解旋酶功能的Cas3蛋白，同时需要Cas5、Cas7等多种Cas蛋白辅助发挥作用；Ⅱ型系统目前发现仅存在于细菌中，其核心蛋白为具有RuvC核酸酶和HNH核酸酶活性的Cas9蛋白；Ⅲ型系统多存在于古细菌中，其核心蛋白为具有RNA酶活性的Cas10蛋白，同时需要Cas6等多种蛋白。三种类型的CRISPR系统发挥作用都需要有Cas1和Cas2等核心Cas蛋白的存在，这是因为Cas1和Cas2蛋白在获得新的间隔序列中具有重要作用。

相对于Ⅰ型和Ⅲ型系统，Ⅱ型系统组分简单，仅需Cas9蛋白、CRISPR RNA（crRNA）与反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）相互作用就能起到靶向切割目的基因DNA的功能，因此在2012年Jinek等[3]率先证明了CRISPR/ Cas9系统对DNA的体外切割作用之后，短短几年间，基于Ⅱ型系统的CRISPR/Cas9系统被迅速改进为应用广泛的基因组编辑工具。

2　CRISPR/Cas9系统的作用机理

CRISPR/Cas9系统的主体结构为前导序列（Leader）、CRISPR基因座和相邻的多个Cas基因组成（图1）。前导序列具有种属特异性，是一段进化保守的非编码序列。前导序列紧邻CRISPR基因座的5′端且富含AT碱基，参与crRNA的转录并决定新的间隔序列插入基因组中的方向。CRISPR基因座位点由高度保守的重复序列（Repeats）与长度不等的间隔序列（Spacers）相间串联而成。

图1　CRISPR/Cas9系统的位点结构

细菌抵抗外源微生物感染的CRISPR/Cas9免疫机制主要分为适应、表达和干扰3个阶段[4]。（1）适应：CRISPR/Cas9系统中的Cas1、Cas2协同其他相关Cas蛋白将外源微生物基因组的某个特定片段整合到CRISPR位点的前导区之后，第一个重复序列之前，在此后的复制中作为一个新的间隔序列存在。（2）表达：前导序列指导CRISPR转录为pre-crRNA时，其5'端的tracrRNA同时转录并通过碱基互补与pre-crRNA形成RNA二聚体，在Cas9与RNAase Ⅲ的联合作用下剪切为成熟的crRNA/tracrRNA二聚体。（3）干扰：成熟的crRNA/tracrRNA二聚体通过碱基互补作用识别外源微生物基因组中的靶位点，在Cas9蛋白核酸酶的作用下切割该靶位点的DNA双链，进而使外源微生物失活。

通过人工改造的CRISPR/Cas9系统切割目的基因片段的作用机理与细菌抵抗外源微生物感染的CRISPR/Cas9机制类似，主要是在形成crRNA/ tracrRNA二聚体的crRNA编码序列中人为替换为目的基因特定位点的序列，从而构建成为能够指导Cas9蛋白特异切割目的基因DNA特定位点的单链向导RNA（Single-guide RNA，sgRNA）。在Cas9蛋白切割目的基因的DNA双链后形成DSBs，并激活细胞的HR和NHEJ两种自我修复机制，从而实现对目的基因组的插入、敲除或修饰等编辑方式（图2）。

图2　CRISPR/Cas9系统的基因组定点编辑方式

3　CRISPR/Cas9技术的应用进展

3.1CRISPR/Cas9应用于植物遗传育种研究

传统植物育种的转基因技术是将外源基因导入植物细胞后通过激活植物细胞的自发同源重组机制随机整合到植物基因组中，进而通过筛选表型获得目标性状的突变株。由于植物中自发同源重组的低效率和整合位点的随机性，长期以来要实现植物基因组的精确编辑比较困难。CRISPR/Cas9系统的出现和应用使得对植物基因组进行高效精确的编辑成为可能。

2013年Mao等[5]率先利用CRISPR/Cas9系统实现了模式植物拟南芥基因组中特定目的基因片段的定点突变。2014年Zhang等通过测试CRISPR/ Cas9系统对2个水稻亚种的11个靶基因的编辑特点，证实CRISPR/Cas9系统在水稻中具有很高的特异性和编辑效率（66.7%）。同年，Wang等[6]利用TALEN和CRISPR-Cas9技术在六倍体面包小麦中成功实现了同时编辑3个同源等位基因，获得了具有白粉病抗性的新品种小麦。CRISPR/Cas9系统为实现作物稳定高效的定向育种（产量、抗性或品质等）提供了有力的遗传学工具。

3.2CRISPR/Cas9应用于动物基因组遗传修饰

2013年Cong等[7]和Mali等[8]几乎同时利用CRISPR/Cas9系统分别在293T细胞、K562细胞和iPS细胞中实现了不同程度的基因敲除，从此开启了真核细胞中基因组高效定点编辑的崭新时代。同年，Wang等[9]通过CRISPR/Cas9技术仅耗时3～4周便一次性获得了同时敲除5个基因的小鼠。

相对于传统的显微注射法和慢病毒介导的RNAi技术的遗传育种方法，CRISPR/Cas9系统的高效率、多靶位、短周期和易筛选等特点迅速掀起了动物基因组遗传修饰的研究高峰，并衍生出了CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）等一系列新兴技术。

2015年Chen等利用CRISPR/Cas9系统靶向沉默猕猴的肌营养不良蛋白基因，显著降低了突变体的肌营养不良蛋白表达和肌肉退化现象。同年，Crispo等利用CRISPR/Cas9技术结合显微注射法制备出敲除肌肉生长抑制素基因的转基因绵羊，转基因效率高达45.5%，远高于常规转基因技术。

要结合系统内近年来发生的腐败问题典型案例，以案释纪、以案促教，让党员干部知敬畏、存戒惧、守底线。抓住关键节点，在干部提任时开展廉政谈话，实施业务分管领导和分管人事工作的领导“双谈话”机制，切实提升教育效果。

3.3CRISPR/Cas9应用于人类疾病模型构建

人类癌症的发生和发展过程中伴随着许多原癌基因和肿瘤抑制基因发生遗传学和表观遗传学的改变，通过培育遗传基因缺陷的小鼠品系对于系统性模拟和研究癌症的发生和发展过程具有重要意义。相对于传统的基于Cre-loxp基因打靶的模型构建方法，CRISPR/Cas9系统成本更低、效率更高，目前已经成功建立起了肝癌、肺癌等多种癌症模型的小鼠品系。

2014年Hai等[10]首次利用CRISPR/Cas9技术高效地获得了双等位vWF基因突变的基因敲除猪，从而建立了血管性血友病的小型猪模型。2016年Yuan等[11]利用CRISPR/Cas9技术靶向修饰兔体基因组的CRYAA基因及GJA8基因，成功构建了具有典型白内障表型的模型兔。CRISPR–Cas9系统应用于高效地构建疾病模型，对于深入研究疾病基础病理学、揭示疾病发展机制和抗病药物筛选等具有重要的意义。

3.4CRISPR/Cas9应用于抗病毒策略研究

由于基因组编辑技术是在DNA水平上对基因组序列进行定点改造和修饰，因此理论上所有DNA病毒和存在DNA状态的病毒都可以通过基因组编辑技术实现病毒特定基因片段的靶向编辑和表达沉默。在CRISPR/Cas9系统出现之前，ZFN和TALEN技术都曾用于病毒感染疾病的治疗，但由于两者构建复杂、靶位受限，CRISPR/Cas9系统的出现为病毒感染疾病的EEN疗法开辟了新途径。

2014年Hu等[12]通过构建靶向编辑人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）LTR U3启动子的gRNA-Cas9质粒，转染实验证实Cas9能够实现整合的HIV原病毒基因组的定点清除。Lin等[13]通过构建靶向乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）基因组的gRNA-Cas9质粒，体外实验证实CRISPR/Cas9系统可明显降低HBV核心蛋白和表面蛋白的表达量。Wang等[14]针对Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus，EBV）基因组的6个不同的功能位点构建了7个gRNA-Cas9质粒，核转染实验发现导入Cas9-gRNA的细胞恢复了正常的凋亡途径，显著增低了EBV致瘤效应。

同ZFN和TALEN技术一样，CRISPR/Cas9系统的脱靶效应（Off-target effects）也会导致细胞毒性，因此如何提高CRISPR/Cas9系统的特异性而不降低打靶效率是实现精准疗法的技术关键。

2014年Shalem等利用慢病毒载体介导64 751条sgRNA构建了靶向沉默几乎覆盖人类基因组全部18 080个基因的全基因组CRISPR-Cas9敲除文库（Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout Library，GeCKO），结合高通量测序技术快速筛选出了黑色素瘤抗药性的相关基因。Zhou等[15]利用GeCKO文库结合高通量测序技术，筛选并鉴定出了白喉毒素和炭疽毒素的细胞表面受体，为进一步研究病原菌与宿主相互作用和信号通路奠定了基础。由于高通量测序筛选数据的分析难度较大，Li等开发出了新的统计学算法——基于模型的全基因组CRISPR/Cas9敲除分析法（the Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR/Cas9 Knockout method，MAGeCK），能够同时进行阳性和阴性选择筛选，具有较高的灵敏度和筛选效率。

目前已有商品化的用于高通量敲除特定基因的CRISPR sgRNA文库，基于基因敲除实现的功能缺失型筛选能够用于深入研究特定基因功能、筛选信号转导通路相关基因以及研制新型靶向药物等方向。

4　CRISPR/Cas9与其他基因编辑技术的对比

同为RNA介导的基因筛选方法，CRISPR/ Cas9和RNAi有着诸多不同：RNAi属于基因下调（Gene knockdown）方法，并不能完全抑制基因的表达，而CRISPR/Cas9属于基因敲除（Gene knockout）方法，可使基因完全失活；RNAi属于RNA水平的转录后基因表达调控，CRISPR系统可以实现DNA水平和RNA水平的基因沉默；RNAi抗病毒策略以降解细胞浆内增殖的RNA病毒为主，CRISPR/Cas9系统目前多用于细胞核内增殖的DNA病毒或存在DNA阶段的RNA病毒；RNAi一般特异性的降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，CRISPRi可同时用于研究多个基因的表达、激活或抑制；RNAi具有ATP依赖性，CRISPR/ Cas9对靶序列的识别具有PAM限制；RNAi作用有一定的时效性、一般不可遗传，CRISPR/Cas9可以产生稳定、高效的遗传改变。作为重要的反向遗传学研究工具，RNAi和CRISPR/Cas9都是通过功能缺失表型来进行基因筛选，而且二者的脱靶效应同样不可忽视。

同为新兴的基因组编辑技术，gDNA引导的NgAgo系统（NgAgo-gDNA）与RNA导向的CRISPR/Cas9系统亦有许多不同：NgAgo-gDNA系统以5'磷酸化的ssDNA为介导，无靶序列的PAM识别限制，特异性和编辑效率高，单碱基的错配就会导致基因编辑效率的明显降低（CRISPR/ Cas9系统容许5个碱基的错配），因此基因编辑位点识别较为严谨，具有较低的脱靶效应。但目前此项技术引起的争议主要是重复性问题，能否改进为新一代的基因组编辑工具还有待于进一步验证，应用前景并不明朗。

同为gDNA引导的DNA编辑技术，SGN系统（Structure-guided endonuclease system）与NgAgo系统相比不再受到靶序列的限制，依赖识别3'flap结构的内切酶功能实现外源报告基因和内源基因DNA特定位点的编辑，主要倾向于产生大片段的基因删除。目前此项技术推广应用的主要障碍是相对较低的内源基因编辑效率，这可能与其识别机制或位点特异性有关，因此仍然需要大量的后续研究工作进行不断优化和探索。

5　结语与展望

CRISPR/Cas9系统是目前为止靶向基因组编辑最高效的反向遗传学工具，在植物遗传育种研究、动物基因组遗传修饰、人类疾病模型构建、抗病毒策略研究和功能基因组学研究等多个领域取得了重要进展。但作为一项崭新的基因组编辑技术，如何降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应成为亟须解决的问题。

目前已经有多个研究小组就提高CRISPR/Cas9系统进行了有益的实践，如双切口酶系统、dCas9-FokI系统等，都能不同程度的降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应。随着对CRISPR/Cas系统结构与功能研究的不断深入，我们有理由相信CRISPR/ Cas9介导的基因编辑技术具有极大的应用潜力和发展前景。

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（责任编辑：朱迪国）

Research Advances in CRISPR/Cas9-mediated Genome Editing and Its Application

Sun Yuzhang1，Sun Mingjun1，Dai Yonglian2，Yin Renfu3，Ding Zhuang3
（1. China Animal Health & Epidemiology Center，Qingdao，Shandong266032；2. Qingdao Institute of Husbandry & Veterinary Science，Qingdao，Shandong266100；3. College of Veterinary Medicine， Jilin University，Changchun，Jilin130062）

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR），together with the associated sequences（Cas genes and Cas proteins）widely exist in adaptive immune system of bacteria and archaea. CRISPR/ Cas9 system，the third generation genome editing technology，which was established on the basis of the type II CRISPR/Cas system，has been widely applied in many fields of life science research. In this review，CRISPR/Cas9's discovery，function mechanism，application progress，and comparison analysis on other emerging genome editing technologies were introduced. Furthermore，the application prospect of the CRISPR/Cas9 system was described.

CRISPR/Cas9 system；genome editing；application progress

S851.3

A

1005-944X（2016）12-0064-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.019

国家公益性行业（农业）科研专项（201303033）；国家自然科学基金资助项目（31402195）；教育部高校博士点基金博导类项目（20110061110005）

丁 壮