基于GC-MS技术毛细支气管炎痰热闭肺证和风热闭肺证的代谢组学研究

边逊，陈超

(南京中医药大学附属南京市中西医结合医院，江苏 南京 210014)



基于GC-MS技术毛细支气管炎痰热闭肺证和风热闭肺证的代谢组学研究

边逊，陈超*

(南京中医药大学附属南京市中西医结合医院，江苏 南京 210014)

目的：采用气相色谱-质谱联用技术的代谢组学方法，分析毛细支气管炎中医痰热闭肺证与风热闭肺证在尿样代谢物的变化差异。方法：收集毛细支气管炎患儿痰热闭肺证(痰热组)57例、风热闭肺证(风热组)20例和健康儿童(对照组)22例。以气相色谱-质谱联用技术对各组受试患儿的尿液样本进行代谢图谱分析，并对潜在的生物标记物进行鉴定。结果：RSV感染组与正常对照组在尿样小分子代谢物表达上存在着明显差异，研究筛选出21种差异性代谢物标志；中医不同证型间亦存在小分子代谢物含量的明显差异，筛出两证型间具有统计学差异的差异生物标志物共13种。结论：痰热闭肺证与风热闭肺证之间的代谢通路改变具有差异性。

代谢组学；毛细支气管炎；痰热闭肺证；风热闭肺证；气相色谱-质谱联用技术

自1999年Nicholson[1]和FiehntW[2]先后提出代谢组学的概念，并将其运用于疾病诊断及药物筛选，在医学科学领域使用越来越广泛。在中医药研究各领域也得到了越来越多的学者关注，在中医儿科证候学研究中的运用尚处于起步阶段[3-4]。本研究采用气相色谱-质谱联用代谢组学技术对毛细支气管炎痰热闭肺证和风热闭肺证患儿尿液小分子代谢物的变化差异进行分析，探析毛细支气管炎中医不同证型的代谢组学特征，以期为毛细支气管炎中医证候学研究提供代谢组学依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

全部病例均为2012年2月—2014年4月南京市中西医结合医院儿科、南医大二附院RSV毛细支气管炎住院患儿，共77例，其中痰热闭肺证57例，年龄最小4个月，最大4.2岁；风热闭肺证组20例，年龄最小6个月，最大4岁。2014年3月—2015年10月南京市妇幼保健医院预防保健科健康体检患儿22例。签署知情同意书。

1.2 诊断标准

西医参照全国高等学校教材《儿科学》(第7版);中医疾病诊断参照普通高等教育“十一五”国家级规划教材、新世纪全国高等中医药院校规划教材《中医儿科学·肺系疾病·肺炎喘嗽》;证候诊断参照国家技术监督局发布《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语证候部分》及新世纪全国高等中医药院校规划教材《中医儿科学·肺系疾病·肺炎喘嗽》的相关内容。排除应激和先天性心脏病、支气管肺发育不良、早产及免疫缺陷等患儿。

1.3 仪器与试剂

旋涡振荡器(型号XW-80A,上海医大仪器厂)；涡旋混合仪(QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；氮气浓缩仪(D10-32，杭州奥盛仪器有限公司)；干燥箱(MOV-212，SANYO，日本)；色谱-质谱分析仪(Thermo，美国)；恒温离心机(Eppendorf，德国)；上样瓶、瓶帽及进样管(CNW，德国)；移液枪若干。

丙酮(色谱纯,南京化工厂)；氯仿(分析纯,南京化工厂)；甲醇(分析纯,南京化工厂)；乙腈(色谱纯,fisher scientific，美国)；双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)含 1%三甲基氯硅烷(TMCS,sigma，美国)；核糖醇(sigma，美国)；氮气(北京华宇辰气体合成公司)；碎冰(自制)。

1.4 标本采集与制备

根据知情同意书，于患儿入院第2天，取清晨取清晨空腹时中段尿液5 mL，经13000 r/min离心10 min。取上清3 mL，分装，先置于-20℃，1周后置-80℃保存；标本测试时将冻存的血清样本在室温下解冻，取200 μL置离心管中，加入20 μL脲酶涡旋充分混匀，置于37℃水浴。并进行常规气相色谱-质谱检测进样前处理工作后，待进样分析。

1.5 分析条件 见表1～2。

表1 两种进样方式

表2 三种升温程序

1.6 数据处理方法

1.6.1 数据提取

在样品测定时，用Agilent MassHunter Workstation软件包中的Data Acquisition软件进行数据采集，然后用Qualitative Analysis对获得的数据进行分子特征识别，分析处理获得的尿样图谱，利用解卷积(分子特征提取算法)功能，寻找丰度随时间一起升高和降低的离子，鉴定它们属于同一化合物。对总离子流(TIC)图进行精确的特征分子提取，提取结果转化为CEF格式文件，导入Mass Profiler Professional(MPP)软件。

1.6.2 统计分析

利用MPP软件处理数据，首先使用精确质量数和保留时间对原始数据进行数据对齐。对齐后对数据归一化处理和数据筛选，即筛选在任意一组超过70%样品中能被检测到的化合物，进而对数据进行统计学分析。采用主成分分析(principal component analysis,PCA)法来描述数据内部的特征。通过PCA得分图(Score plot)获得样本分类信息，发现可作为生物标记物的化合物。本实验对数据进行PCA，通过PCA得分图(Score plot)获得样本分类信息，通过PCA载荷图(Loading plot)发现可作为生物标记物的化合物。在PCA寻找到的生物标记物的基础上用PLS-DA 进行建模，来考察生物标记物对于毛细支气管炎中医不同证候筛选的准确度和灵敏度。多维统计中找出差异代谢物，并应用SPSS11.0统计软件进行Kruskal-Wallis检验和单因素ANOVA分析的验证，结合VIP值大于1并具有统计学意义(P<0.05)的代谢物确定为潜在标记物。

2 结果

2.1 尿液气相色谱-质谱代谢轮廓分析

对比三组尿液样本气相色谱-质谱联用总离子色谱流图，具体见图1～3，可以看出在相同保留时间下毛细支气管炎组与正常对照组相比很多离子峰高、峰面积存在着明显差异。证明同一物质在两者之间含量不同，表明在RSV感染的疾病状态下，体内的一些小分子代谢物通路发生了异常；中医不同证型间亦存在小分子代谢物含量的明显差异。

图1 对照组总离子图

图2 风热闭肺组总离子图

图3 痰热闭肺组总离子图

2.2 潜在标志物

采用GC-MS仪器自带的相似匹配软件结合保留时间，通过PCA法等分析，经SIMCA-P软件分析并经过谱库鉴定得出差异代谢物，具体代谢差异物生物标志热图见图4，图中每列代表一个代谢物，每行代表一个样本，样本排序为正常对照组、风热闭肺组、痰热闭肺组。分析得出毛细支气管炎患儿相比健康对照组有统计学意义的差异表达血清代谢物有21种：尿酸，黄嘌呤核苷，肉毒碱，嘧啶，呋喃酮，1-苏氨酸，丙酸，1-丙氨酸，乙酸，1H-咪唑-胺类，D-左旋糖，L-苏糖醇，丁酸，L-苏糖酸，赤藓糖醇，L-谷氨酰胺，L-赖氨酸，犬尿酸，色胺酸，肌酐，4,8-二羟基喹啉-2-甲酸，其中痰热闭肺组与风热闭肺组之间相比具有统计学差异的表达代谢物有13种：肉毒碱，尿酸，1-苏氨酸，嘧啶，丁酸，L-苏糖酸，赤藓糖醇，L-苏糖醇，果糖，1-赖氨酸，，L-谷氨酰胺，犬尿酸，肌酐。具体差异性比较见表3。

表3 各组尿液样本差异代谢标志物筛选结果比较

图4 尿液样本中筛选所得生物标志物的热图

3 讨论

急性毛细支气管炎是婴幼儿时期临床最为常见的呼吸系统疾病，临床上以喘憋为特征，好发于3岁以内患儿，沈军等收集了2007全年的992例急性下呼吸道感染患儿痰标本进行病原学分析，结果发现RSV阳性标本268份，为最重要的感染病原，且冬季为RSV感染高峰，3月龄以下儿童检出率为36．4%，3足月到6月龄以下儿童检出率为49．5%，2岁以下儿童占92.5%[5]，近年来随着越来越多的临床研究表明，RSV毛细支气管炎后易发生反复喘息，且RSV感染与小儿支气管哮喘的形成和反复发作的关系最为密切[6]。Sigurs等对年龄小于1岁RSV下呼吸道感染患儿进行长达7年的前瞻性研究，结果显示其日后反复喘息及哮喘的发生率分别为68%和30%[7]。临床以中医痰热闭肺证居多数，汪受传[8]等观察75例病毒性肺炎住院患儿，其中80%属痰热闭肺证，其余为风热犯肺证(8.0%)、肺脾气虚证(5.3%)、阴虚肺热证(4.0%)和风寒袭肺证(2.7%)，认为痰热壅阻、肺气闭塞是小儿病毒性肺炎的主要病机。

代谢组学是现代系统生物学中的一门新兴学科，自2009年SlupskyCM[9]首次提出基于NMR的代谢组学研究方法可能适用于肺炎的病因快速诊断，在未来肺炎的医学研究中具有明显优势，通过寻找与生长发育及疾病发生、发展、转归相关的生物标记物群，确定代谢物与健康和疾病的关联性，从而为临床干预治疗提供科学依据。本研究采用GC-MS代谢组学技术分析毛细支气管炎中医不同证候患儿尿液代谢物发现，毛细支气管炎患儿与健康对照组之间在小分子代谢物表达水平具有明显差异，共筛出具有统计学意义的差异表达血清代谢物21种：尿酸，黄嘌呤核苷，肉毒碱，嘧啶，呋喃酮，1-苏氨酸，丙酸，1-丙氨酸，乙酸，1H-咪唑-胺类，D-左旋糖，L-苏糖醇，丁酸，L-苏糖酸，赤藓糖醇，L-谷氨酰胺，L-赖氨酸，犬尿酸，色胺酸，肌酐，4,8-二羟基喹啉-2-甲酸，其肉毒碱、尿酸、呋喃酮、1-苏氨酸、乙酸、L-苏糖酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、肌酐、2氨-咪唑这11种代谢物具有显著统计学差异(P<0.001)；痰热闭肺组与风热闭肺组之间相比具有统计学差异的表达代谢物有13种：肉毒碱、1-赖氨酸、L-谷氨酰胺、肌酐(P<0.001)，L-苏糖醇、1-苏氨酸、赤藓糖醇、尿酸(P<0.01)，提示痰热闭肺证与风热闭肺证之间的代谢通路改变具有差异性。

代谢组学是通过分析生物体内内源性小分子代谢物的动态变化，描绘出生物体代谢轮廓，现代医学运用代谢组学技术描绘并筛选机体疾病状态下的小分子代谢物的差异性生物标志物，可以进一步探索内源性物质代谢与疾病的关系[10-11]，本研究采用GC-MS代谢组学技术从代谢组学小分子水平初步反映了小儿毛细支气管炎痰热闭肺证、风热闭肺证的尿样代谢特征，为从生物代谢的角度研究中医证候的现代科学内涵提供了一定的实验依据，为今后中医儿科证候学研究做出了有益探索。

[1] Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E. ‘Metabonomics’:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica,1999,29(5):1181-1189.

[2] Oliver F. Metabolomics-the link between genotypes and phenotypes[J].Plant Molecular Biology,2002,48(1-2):155-171.

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[4] 汪受传,杜丽娜,单进军,等.应用代谢组学探讨小儿病毒性肺炎中医证候标准化的研究思路[J].中医儿科杂志,2013,10(1):1-3.

[5] 沈军,朱启镕,俞蕙,等.急性下呼吸道感住院儿童病原及临床流行病学分析[J].中华传染病杂志,2009，27(11):668-672.

[6] 童黄锦,许惠琴,范欣生.呼吸道合胞病毒感染与哮喘的关系[J].时珍国医国药,2008,19(6):1352-1354.

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[9] Slupsky CM, Cheypesh A, Chao DV, et al. Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus Pneumonia Induce Distinct Metabolic Responses[J].Journal of Proteome Research,2009,8(6):3029-3036.

[10] 李长明，李玲孺，陈禹，等.应用代谢组学技术进行中医体质研究探讨[J].中医药学报，2016,44(2):1-3.

[11] 朱明雪，李奇玮，尚雨嫣，等.基于代谢组学的补益剂与其对应虚证的相关性研究[J].中医药学报，2015,43(5):12-15.

南京市医学科学发展十二五重大项目(No.ZDX12012)

边逊(1962-)，女，主任医师，主要研究方向：小儿呼吸系统疾病。

陈超*(1977-)，女，主治医师，博士，主要研究方向：中医儿科肺系疾病。

2016-04-06

R285.6

A

1002-2406(2016)06-0066-04

修回日期：2016-05-01