青钱柳叶香豆素、黄酮含量测定及抗氧化活性研究

刘贤贤，陈刚，杨起群，苏玉卿

（1.桂林师范高等专科学校化学与药学系，广西桂林 541001；2.桂林伯林生物技术有限公司，广西桂林 541003）

青钱柳叶香豆素、黄酮含量测定及抗氧化活性研究

刘贤贤1，陈刚1，杨起群1，苏玉卿2

（1.桂林师范高等专科学校化学与药学系，广西桂林 541001；2.桂林伯林生物技术有限公司，广西桂林 541003）

分析青钱柳叶中的香豆素和黄酮含量，比较了不同产地青钱柳叶中香豆素和总黄酮含量的差异，对青钱柳叶进行了体外抗氧化活性实验，结果表明：桂林伯林生物技术有限公司种植的青钱柳总黄酮含量和香豆素含量都较高，分别为2.8135%和6.9253%，高于湖南省绥宁县、江西省修水县的青钱柳叶总黄酮含量和香豆素含量。青钱柳叶有较好的清除羟自由基的能力，是一种较好的天然抗氧化剂，具有较高的开发价值。

青钱柳叶；香豆素；总黄酮；抗氧化活性

青钱柳（Cyclocarya paliurus(Batal.)I1jinskaya）别名:摇钱树、麻柳，青钱李等。我国南方多省均有发现，多以零星分布。青钱柳乃冰川四纪幸存下来的珍稀树种，仅存于中国。[1]青钱柳被誉为植物界的大熊猫，医学界的第三棵树。青钱柳叶含有多糖、氨基酸、黄酮、香豆素、生物碱、甾体、萜类、苷类、维生素E等化学成分和人体必需的一些微量元素，[2]《中国中药资源志要》记载，青钱柳叶具有清热、消渴、解毒之功效。此外，青钱柳还可以抑制葡萄糖的吸收，降低人体血糖，从而预防由高血糖引起的一系列病症。[3]本研究主要对青钱柳叶的香豆素、黄酮含量进行测定，用青钱柳叶提取物对羟基自由基（·OH）进行体外抗氧活性研究，为开发出具有地方特色的植物保健产品作前期准备。

一、实验材料与方法

（一）实验材料

青钱柳叶（采自桂林伯林生物技术有限公司药用植物种植基地）、芦丁标准品（AR）、水合氧化前胡素内酯、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、甲醇（AR）、乙醇（AR）、乙醚、1,1-二苯基-2-三硝基甲苯肼(1，1-Di⁃phenyl-2-TNT Thydrazine DPPH.)、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、双氧水（H2O2）、邻二氮菲（1,10-菲咯啉）

（二）主要仪器与设备

紫外可见分光光度计(SPECORD200，德国耶拿公司)，电热鼓风干燥箱(GZX-9140MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，数控超声波仪(KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司)，电子分析天平(FB224，上海舜宇恒平科技仪器有限公司)，粉碎机（HC-200，浙江省永康市金穗机械制造厂），移液枪（GP01370、YE3K044727、DR36878，大龙行创实验仪器（北京）有限公司），ZNHW HEATER电热套加热器、80-2型离心沉淀机、SPECORD200吸光仪、旋转蒸发器(RE-2000B，上海亚荣生化仪器厂)，数显恒温水浴锅(HH-2，上海淮城仪器有限公司)。

（三）实验方法

1.青钱柳叶浸膏的制备

青钱柳叶自然晾干→粉碎过筛→称重→加入不同溶剂→浸泡→进行不同溶剂的超声波提取→抽滤→蒸发浓缩→青钱柳浸膏。

将新鲜的青钱柳叶自然晾干，用粉碎机将其粉碎，称取一定重量的青钱柳粉，分别用一定体积的50%乙醇、65%甲醇浸泡24小时，在45℃～55℃温度，85×103～100×103Hz频率下，进行超声波浸提2次，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩，即得到不同提取溶剂的青钱柳叶浸膏。

2.香豆素含量的测定（紫外分光光度法）

（1）水合氧化前胡素内酯标准曲线的绘制

精密称取水合氧化前胡素内酯对照品3.0mg，至10ml容量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀，即得标准溶液（每1ml标准液含水合氧化前胡素内酯0.3mg/ml）。

精密吸取上述标准溶液5.0ml至50ml容量品中，定容。分别吸取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.7ml，用甲醇稀释定容到10ml容量瓶中，摇匀，在307nm波长处测定吸光度。以水合氧化前胡素内酯对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

（2）青钱柳叶中香豆素含量的计算

采用分光光度法测定青钱柳叶香豆素的含量。分别称取65%甲醇青钱柳叶浸膏和70%乙醇青钱柳浸膏适量，加甲醇和乙醇溶解定容至50ml容量瓶中，摇匀。精密吸取1ml，加甲醇和乙醇定容至10ml容量瓶中，摇匀。取一定量溶液，以甲醇试剂做对照，用分光光度计在307nm处测其吸光度。

根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的水合氧化前胡素内酯含量，按下式求出香豆素含量（以水合氧化前胡素内酯计）。

公式①X=［（m1v2）/(mv1)×103］×100%

式中，x为样品中香豆素含量（以水合氧化前胡素内酯计），m1为根据标准曲线计算出待测液中香豆素的量（mg），m为样品质量（g），V1为测定样品提取液体积（ml），V2为样品提取液总体积（ml）。

3.总黄酮含量的测定（硝酸铝比色法）

（1）芦丁（芸香叶苷）标准曲线的绘制

准确称取在105℃条件烘至恒重的芦丁标准品约10mg，用70%乙醇定容至100ml，摇匀，即得芦丁标准溶液（每1ml标准液含芦丁0.1mg）。

精确吸取芦丁标准溶液0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、和5.0ml（相当于芦丁0.0mg，0.10mg，0.20mg，0.30mg，0.40mg，0.50mg），分别置入6支10ml刻度容量瓶中，用蒸馏水定容至5.0ml，各加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min后，加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min，再加4%氢氧化钠溶液4ml，加蒸馏水0.4ml，摇匀，放置15min后，用分光光度计测其吸光度。（以不加芦丁的空白管为对照调零），以芦丁标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制芦丁标准工作曲线。

（2）青钱柳样品的处理[4]

分别准确称取一定重量的干粉青钱柳样品，将粉末装入折好的滤纸筒内，置于索式提取器的浸提管内，采用索式提取法，选用无水乙醚作为脱脂剂，于45-50℃脱脂约12小时。充分脱去样品中游离之类和脂溶性色素。取出样品滤纸筒,挥干无水乙醚，将滤纸筒烘干，得到脱脂干粉样品。

（3）浸提

取一定量的脱脂样品，分别用浓度为50%的乙醇在45℃～55℃、85×103～100×103Hz条件下用超声波回流浸提2次，合并浸提液，并适当浓缩，定容至250ml待测。

（4）提取液中黄酮类化合物含量的测定

本文参照文献[5]中亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定青钱柳70%乙醇提取液的黄酮含量，在510nm处测吸光度，以芦丁为标准建立标准曲线。

（5）青钱柳总黄酮含量的测定

取一定体积的总黄酮类化合物提取液在4000r/ min下离心15min，精确吸取上层清液0.5ml放入洁净干燥的10ml容量瓶中，补水至5ml，各加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min，加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min，再加入4%氢氧化钠溶液4ml，加蒸馏水0.4ml，摇匀，放置15min后，以试剂空白做对照，用分光光度计在510nm波长处测其吸光度。

根据标准工作曲线求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮含量（以芦丁计）。

式中为样品中总黄酮含量(以芦丁计)，m1为根据标准曲线计算出样品提取液中总黄酮的量(mg),m为样品质量(g),V1为测定提取液体积(ml),V2为提取液总体积(ml).

4.青钱柳叶提取物对羟基自由基（·OH）的清除能力的测定（邻二氮菲-亚铁离子氧化(Feton)法）

取1ml邻二氮菲溶液（摩尔浓度为0.75mmol/L),分别加入2mL磷酸缓冲液(pH为7.4)和1mL样品溶液,充分混匀,再加入1mL硫酸亚铁溶液(摩尔溶度为0.75 mmol/L),混合均匀,最后加入1mL新鲜的双氧水(0.01%),迅速置于37℃水浴保温60min后,放至室温,于536nm波长下测其吸光值。每个浓度平行做3管，取其平均值。同时做空白对照实验,用1mL超纯水代替双氧水测其吸光值；用1mL的无水乙醇代替1mL样品溶液,测吸光值。按下列公式计算其清除率。

清除率%=[（As-Ap）×100]/(Ab-Ap)

其中As是样品测试值，Ab是不加双氧水的试样测试值，Ap是无样品的试样测试值。

二、实验结果及讨论

（一）青钱柳叶浸膏香豆素含量的测定

1.水合氧化前胡素内酯标准曲线的绘制

按照“水合氧化前胡素内酯标准曲线的绘制”的实验方法，在307nm波长处分别测定不同浓度的水合氧化前胡素内酯标准品的吸光度，实验数据见表1。

表1 水合氧化前胡素内酯标准品吸光度

根据表1的数据，绘制水合氧化前胡素内酯的标准曲线图，如图1所示：

图1 水合氧化前胡素内酯标准品溶液回归曲线

由图2得到线性方程为：Y=5.3733X-0.003，相关系数R2=0.9989，Y为吸光度；X为水合氧化前胡素内酯浓度（mg/ml）。

2.65%甲醇青钱柳叶提取浸膏香豆素含量的测定

称取65%甲醇的青钱柳叶浸膏适量，加甲醇溶解定容至50ml容量瓶中，摇匀。精密吸取1ml，加溶剂定容至10ml容量瓶中，摇匀。取一定量溶液，以甲醇或乙醇试剂做对照，用分光光度计在307nm处测其吸光度。

根据图2的水合氧化前胡素内酯标准回归曲线和公式①计算得香豆素含量，结果见表2、表3

由表2、表3可知：在45℃～55℃温度、85×103～100×103Hz频率下，采用65%甲醇做提取溶剂，对桂林伯林生物技术有限公司种植的青钱柳叶进行超声波浸提，所获得浸膏的香豆素类化合物的含量较高，为6.9253%，比江西省修水县种植的青钱柳高2.6953%，比湖南省绥宁县种植的青钱柳高0.2953%。

表2 超声波提取的65%甲醇浸膏香豆素含量的研究

表3 不同产地青钱柳叶中香豆素含量的比较

图2 芦丁标准品的回归曲线

本实验测得三份青钱柳叶粉末样品的总黄酮含量见表4。

由表4、表5可知：在45℃～55℃温度、85×103～100×103Hz频率下，采用50%乙醇做提取溶剂，对桂林

（二）青钱柳叶总黄酮含量的测定

1.芦丁（芸香叶苷）标准曲线的绘制

按照“芦丁（芸香叶苷）标准曲线的绘制”的实验方法，在510nm波长处分别测定不同浓度的芦丁标准品的吸光度，芦丁标准线性回归方程Y=1.2011X+ 0.0147，相关系数R2=0.996，芦丁浓度在0.12-0.60mg/ ml范围与吸光度呈线性关系。如下图所示：

2.青钱柳总黄酮含量的测定（硝酸铝比色法）伯林生物技术有限公司种植的青钱柳叶进行超声波浸提，青钱柳总黄酮类化合物的含量较高，为2.8135%，比江西省修水县种植的青钱柳高1.5535%，比湖南省绥宁县种植的青钱柳高0.8435%。

（三）青钱柳叶提取物对羟基自由基（·OH）的清除能力的测定（邻二氮菲-亚铁离子氧化(Feton)法）

新鲜的青钱柳叶自然晾干，用粉碎机将其粉碎，称取一定重量的青钱柳粉，用65%甲醇浸泡24小时，在45℃～55℃温度、85×103～100×103Hz频率下，进行超声波浸提2次，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩，即得青钱柳叶浸膏。

表4 青钱柳总黄酮类化合物的含量

表5 不同产地青钱柳叶中总黄酮类化合物含量比较

把所获得的青钱柳叶浸膏分别制成一定浓度的溶液，用邻二氮菲-亚铁离子氧化(Feton)法测定各提取物对羟基自由基（·OH）的清除能力，实验数据见图3

图3 提取的青钱柳浸膏对羟基自由基（·OH）的抑制率

根据图3的线性方程，计算出65%甲醇的青钱柳叶浸膏清除羟自由基的IC50(g/ml)为1.944×10-4。在相同实验条件下，对羟自由基清除能力可通过IC50的大小来判定，IC50越小，说明羟自由基的清除能力越强，抗氧活性效果越好，本实验的青钱柳叶浸膏对羟自由基清除活性的IC50为1.944×10-4，说明青钱柳叶有较好的清除羟自由基的能力。

三、结论

青钱柳被称为医学上的第三棵树，它具有护肝、扩冠、降低血管脆性，增强心脏收缩，降血糖、降血脂等多种生理活性，有一定程度的抗菌及抑制肿瘤的作用。上述实验结果表明：桂林伯林生物技术有限公司种植的青钱柳总黄酮含量和香豆素含量都较高，分别为2.8135%和6.9253%，高于湖南省绥宁县、江西省修水县的青钱柳叶总黄酮含量和香豆素含量。青钱柳叶提取物对羟基自由基（·OH）的清除能力的测定实验说明，青钱柳叶有较好的清除羟自由基的能力，是一种较好的天然抗氧化剂。青钱柳的功效已被临床研究所证实，说明其具有一定的开发价值。研究表明：本实验所采用的桂林伯林生物技术有限公司种植的青钱柳具有较高的开发价值。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员.中国植物志：第21卷[M].北京：科学出版社，1979.

[2]李俊，陆园园，许子竞，等.青钱柳中总黄酮成分的研究[J].中药材，2005,28（12）：1058-1059

[3]KURIHARA H,FUKAMI H.Hypoglycemic action ofCyclo⁃caryaPaliurus(Batal.)IlJinskajainnormalanddiabeticmice[J]. BiosciBiotechnolBiochem,2003,67(4):877-88.

[4]张莉，陈乃富，吴美.蕨根茎及老嫩叶中黄酮含量的比较[J].食品与发酵工业.2006,32(11):43-46.

[5]卢文芸，许文琴，于锡忠等.贵州野生蕨菜中总黄酮含量的测定与分析[J].贵州农业科学.2012,40(5):47-49.

[6]陈金华，黄建安，刘仲华.青钱柳叶的化学成分分析[J].食品工业科技，2009,7（30）：159-161.

Determining the Content of Coumarin and Flavonoids and Studing the Activities of Antioxidant from Cyclocarya Paliurus Leaf

Liu Xianxian,Chen Gang,Yang Qiqun,Su Yuqing
(1.Department of Chemistry and Pharmacy,Guilin Normal College,Guilin,Guangxi 541001,China; 2.Guilin Berlin BioTechnology Co.,LTD,Guilin,Guangxi 541003,China)

They analyze the content of coumarin and flavonoids in Cyclocarya paliurus leaves,and compare the coumarin and flavonoids content in different cultivation zones of Cyclocarya paliurus leaves,and test in vitro antioxidant activity of Cyclocarya paliurus.The results show that the contents of flavonoids and coumarin in Guilin Berlin biotechnology co.,LTD.,are 2.8135%and 6.9253%higher than those of Suining County,Hunan,and Xiushui County,Jiangxi.Cyclocarya paliurus,scavenging hydroxyl radicals,is a good natural antioxidant which has high value for development.

Cyclocarya paliurus leaf;coumarin;flavonoids;antioxidant activity

O69

A

1001-7070（2016）06-0123-04

(责任编辑：杨建香)

2016-09-01

2015年广西教育厅科研项目“基于功能纳米材料电化学传感器的制备及应用研究”(项目编号：KY2015YB368)；桂林市科学研究与技术开发计划项目“青钱柳组培快繁体系的建立及其栽培技术研究”（项目编号：20140303-2）。

刘贤贤（1963-），女，广西平乐人，桂林师范高等专科学校化学与药学系教授，主要从事天然产物提取分离与活性筛选及有机合成。