纳米二氧化钛皮肤暴露对小鼠脑和血管的毒性研究

郭 晴，刘志敏，李潇潇，赵 云，沈世平，蔡 洁，袁均林，杨 旭，李 睿

(华中师范大学生命科学学院 湖北省遗传调控和整合生物学重点实验室，湖北 武汉 430079)



纳米二氧化钛皮肤暴露对小鼠脑和血管的毒性研究

郭 晴，刘志敏，李潇潇，赵 云，沈世平，蔡 洁，袁均林，杨 旭，李 睿

(华中师范大学生命科学学院 湖北省遗传调控和整合生物学重点实验室，湖北 武汉 430079)

为研究纳米二氧化钛(nano-TiO2)对小鼠脑和血管的毒性，将56只小鼠随机分为8组，每组7只，分别为control、solvent control、4 mg·kg-1nano-TiO2、20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2、500 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1维生素E(VE)+100 mg·kg-1nano-TiO2和100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2，采用皮肤涂抹的方式，对小鼠进行连续42 d暴露。结果表明：4 mg·kg-1nano-TiO2和20 mg·kg-1nano-TiO2对小鼠的大脑毒性和血管损伤较低，100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2对小鼠的大脑毒性和血管损伤明显，暴露中VE的添加对nano-TiO2给脑和血管造成的损伤具有一定的缓解作用。初步证明nano-TiO2皮肤暴露在一定剂量下可对小鼠脑和血管引起毒性作用，其原因可能为氧化损伤。

纳米二氧化钛；毒性；小鼠；皮肤暴露

随着纳米技术的发展，越来越多的纳米材料应用到药载系统、抗菌材料、化妆品以及电子产品中[1-2]。TiO2是一种常见的纳米材料，具有极强的催化能力、较小的尺寸[3]以及紫外吸收[4]等特点，被作为防晒霜中的一种保护成分。随着防晒霜的使用越来越普遍，TiO2对人体的安全性问题逐渐引起了研究者的关注。有研究者认为TiO2不能穿过完整的皮肤屏障。如Sadrieh等[5]将微米级TiO2、纳米级TiO2以及用氢氧化铝和二甲聚乙烷聚合物修饰过的nano-TiO2，以2mgcream/cm2的浓度涂抹于小型猪的皮肤上，结果表明nano-TiO2颗粒不能穿过完整的表皮。但是也有研究证明nano-TiO2可以穿过皮肤。如人的包皮被移植到严重联合免疫缺陷小鼠上，利用透射电子显微镜和质子激发X荧光光谱分析法，观察到nano-TiO2颗粒可进入到达皮肤的角质层[6]。Wu等[7]将nano-TiO2暴露于离体的猪皮24h，结果表明nano-TiO2没有穿过皮肤的角质层；但是将nano-TiO2涂抹到活体猪耳朵上30d，发现nano-TiO2可以穿过猪的角质层，且最终分布到较深的表皮层；此外将nano-TiO2颗粒涂抹于裸小鼠的皮肤上，nano-TiO2可穿过皮肤进入不同的组织，并可引起一些组织损伤。这些结果表明nano-TiO2长时间暴露于人的皮肤，有可能对人体造成损伤。

纳米颗粒可以通过各种途径进入血液进而到达各个组织器官[8]。Liu等[9]研究表明，nano-TiO2通过腹腔注射后可以经血液循环进入大脑。Hu等[10]利用灌胃方式将nano-TiO2暴露于小鼠，结果表明nano-TiO2长期低剂量的暴露，有可能对小鼠大脑造成损伤。此外，nano-TiO2还可以通过呼吸系统进入大脑[11]。因此，化妆品中的nano-TiO2是否会穿过皮肤经血液循环进入大脑，对人的血管系统和大脑造成危害值得探讨。作者采用皮肤涂抹的方式将nano-TiO2暴露于小鼠42d，探究nano-TiO2对小鼠脑和血管的影响。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

无特定病原体(specific pathogen free,SPF)雌性BALB/c小鼠,湖北省预防医学科学院动物实验中心。

nano-TiO2(白色粉末，含量85%～90%)，江苏河海纳米科技股份有限公司；2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)、硫代巴比妥酸(TBA)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，Sigma-Aldrich公司；维生素E(VE)，国药集团化学试剂有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天公司；小鼠血栓调节蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒、小鼠可溶性细胞粘附因子1酶联免疫吸附检测试剂盒、小鼠D-二聚体酶联免疫吸附试剂盒，上海蓝基生物科技有限公司；小鼠IL-4酶联免疫吸附检测试剂盒、小鼠IFN-γ酶联免疫吸附检测试剂盒、小鼠IgE酶联免疫吸附检测试剂盒，eBioscience公司。

Eppendorf 5415R型低温冷冻离心机，Beckman公司；-20 ℃冰箱、玻璃匀浆器，广东科龙公司；-80 ℃超低温冰箱，日本Sanyo公司；ML-902型定时恒温磁力搅拌器，上海浦江分析仪器厂；FLx800型荧光酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司；JN-3200DT型超声处理器，宁波江南仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 染毒方式

56只6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为8组，每组7只，分别为control、solvent control、4 mg·kg-1nano-TiO2、20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2、500 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2和100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2。分组之后先进行一周的实验室环境饲养，然后每天对小鼠进行脱毛处理。按0.01 mL·(g体重)-1对小鼠进行皮肤涂抹染毒，染毒周期为42 d。nano-TiO2用溶剂进行配制，实验前用超声处理器进行超声分散，VE用生理盐水配制，染毒期间小鼠均可自由进水进食。

1.2.2 脑组织样品制备

第42 d染完毒24 h后，先对小鼠进行心脏取血，然后取出脑置于冰上，按10 mL·g-1添加PBS溶液(pH=7.5)。使用玻璃匀浆器配制成脑组织匀浆。将脑组织匀浆在4 ℃、10 000 r·min-1的条件下离心10 min，收集上清液置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 活性氧簇(ROS)含量的测定

ROS含量采用DCFH-DA[12]法进行检测。DCFH-DA本身不具备荧光特征，但其可进入细胞，在胞内被水解产生DCFH，DCFH可与胞内的ROS发生反应，被氧化生成DCF，DCF具有荧光特征，其荧光强弱将间接地反映细胞内ROS含量的多少。

实验步骤如下：用PBS溶液(pH=7.5)将匀浆上清液稀释100倍；用排枪取100 μL稀释液加入酶标板中；加入100 μL荧光染料染色，避光反应20 min;利用荧光酶标仪测出485 nm激发光、525 nm发射光下的荧光强度。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的测定

采用TBA法测定MDA的含量[13]。MDA能够与TBA反应缩合形成红色产物，通过吸光值的测定可以计算出MDA的含量。

实验步骤如下：取500 μL匀浆上清液于试管中，加入2 mL 0.6 % TBA，沸水浴15 min；取1 mL 上清液于EP管中，100 000×g离心5 min；取100 μL上清液于酶标板中；用酶标仪测出532 nm、600 nm和450 nm波长处的吸光值，按照下式计算MDA的含量(μmoL·g-1)：MDA含量 = 6.45× (OD532-OD600)-0.56×OD450。

1.2.5 谷胱甘肽(GSH)含量的测定

采用DTNB法测定GSH含量[14]。DTNB可以在黑暗的条件下与GSH反应形成黄色化合物TNB。

实验步骤如下：取200 μL匀浆上清液，加入1 mL有机溶剂(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)，用涡旋仪混合均匀，在冰上静置10 min后，100 000×g离心5 min；在不破坏蛋白层的情况下，取上清液50 μL加入酶标板，加150 μL浓度为60 ng·mL-1的DTNB，室温下避光反应5 min；用酶标仪测出412 nm波长处的吸光值。

1.2.6 脑组织IL-4和IFN-γ含量的测定

实验原理：采用双抗夹心法ELISA来检测抗原。将纯化的抗小鼠IL-4和IFN-γ(一抗)预先包被在酶标板每个微孔底部，使其充分吸附在固相载体上，加入待测样品或标准品，待测物质与抗体结合后，加入酶标二抗，待二抗与待测物质结合后，加入酶反应底物，充分显色后终止反应，通过检测吸光值绘制标准曲线，计算出样品中待测物质的含量。

取匀浆上清液测定其中IL-4和IFN-γ的含量，按照成品ELISA试剂盒步骤完成测定内容。

1.2.7 血清中TM、sICAM-1、D2D和Ig-E含量的测定

实验原理同1.2.6。

取匀浆上清液测定其中TM、sICAM-1、D2D和Ig-E的含量，按照成品ELISA试剂盒步骤完成测定内容。

1.3 统计分析

数据采用Origin 6.1统计软件进行t检验处理，比较暴露组与对照组测量值的差异：P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。利用Prism进行作图。

2 结果与讨论

2.1 nano-TiO2的形态特征(图1)

图1 nano-TiO2的扫描电子显微镜(SEM)照片

由图1可知，nano-TiO2在SEM下呈片层结构，粒径约为15～40 nm，表面光滑。本防晒剂用nano-TiO2对可见光具有很高的透过性，对紫外线有很好的阻隔作用，广泛适用于美白润肤露、美白面霜、防晒霜等化妆品中。

2.2 nano-TiO2暴露后小鼠脑组织氧化应激指标的测定(图2)

图2 nano-TiO2暴露后小鼠脑组织氧化应激指标的测定

由图2a可知，小鼠脑组织中ROS含量随nano-TiO2暴露量的增加逐渐升高，与对照组相比，4 mg·kg-1nano-TiO2暴露组ROS含量显著升高 (P<0.05)，20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的ROS含量分别出现极显著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，ROS含量出现显著性下降(P<0.05)；100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，ROS含量出现极显著性下降(P<0.01)。

由图2b可知，小鼠脑组织中GSH含量随nano-TiO2暴露量的增加逐渐降低，与对照组相比，100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组GSH含量显著降低 (P<0.05)，500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组GSH含量极显著降低 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与相应的100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，GSH含量都呈升高的趋势，但是无统计学意义。

由图2c可知，小鼠脑组织中MDA含量随nano-TiO2暴露量的增加逐渐升高，与对照组相比，100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的MDA含量显著升高 (P<0.05)；500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的MDA含量极显著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与相应的100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，小鼠脑组织中MDA含量都呈下降趋势，但是无统计学意义。

2.3 nano-TiO2暴露后小鼠脑组织炎症指标的测定(图3)

图3 nano-TiO2暴露后小鼠脑组织炎症指标的测定

由图3a可知，与对照组相比，100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的IL-4含量均极显著升高 (P<0.01);100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与相应的100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，小鼠脑组织IL-4含量均出现显著性降低(P<0.05)。

由图3b可知，与对照组相比，500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的IFN-γ含量显著升高 (P<0.05)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与相应的100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，小鼠脑组织中IFN-γ含量虽有一定程度的升高，但是无统计学意义。

2.4 nano-TiO2暴露后小鼠血清中Ig-E、D2D、sICAM-1和TM含量的测定(图4)

由图4a可知，与对照组相比，20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的Ig-E含量均极显著升高 (P<0.01);100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，Ig-E含量呈显著性下降(P<0.05)；而100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，Ig-E含量呈下降趋势，但是无统计学意义。

由图4b可知，与对照组相比，100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的D2D含量均极显著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，D2D含量呈显著性下降(P<0.05)；100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，D2D含量呈极显著性下降(P<0.01)。

图4 nano-TiO2暴露后小鼠血清中Ig-E、D2D、sICAM-1和TM的含量

由图4c可知，与对照组相比，4 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的sICAM-1含量显著升高 (P<0.05)，20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的sICAM-1含量均极显著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与相应的500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组、100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，sICAM-1含量都呈下降趋势，但是无统计学意义。

由图4d可知，与对照组相比，4 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的TM含量显著升高 (P<0.05)，20 mL·g-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组的TM含量均极显著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，TM含量显著性下降(P<0.05)；而100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组与100 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，TM呈下降趋势，但是无统计学意义。

2.5 讨论

2.5.1 nano-TiO2暴露后对小鼠脑组织的影响

研究表明，纳米材料的毒性机制主要是氧化损伤造成的ROS失衡[15-16]。细胞内的ROS增多时抗氧化剂就会清除多余的ROS，当抗氧化剂无法清除多余的ROS时，就会导致ROS在细胞内产出和清除失衡，引起氧化应激反应，造成蛋白质、脂质以及DNA等大分子的损伤[17]。氧化水平可以分为3个层次[18]：低水平的氧化应激会通过机体的自我保护作用来清除多余的ROS，一般不会引起机体的损伤；中水平的氧化应激不会完全清除体内多余的ROS，多余的ROS会造成一些组织损伤；高水平氧化应激会产生炎症反应，进一步对机体造成损伤。因此，本实验通过测定小鼠脑组织的ROS、GSH和MDA氧化应激指标以及IL-4和IFN-γ炎症指标来检测不同浓度的nano-TiO2通过皮肤涂抹方式对小鼠大脑的影响，结果表明，低剂量(4 mg·kg-1和20 mg·kg-1)的nano-TiO2对小鼠的大脑毒性较弱，只有较高剂量(100 mg·kg-1和500 mg·kg-1)的nano-TiO2才对小鼠的大脑有明显的影响(图2和图3)。

2.5.2 nano-TiO2暴露后对小鼠血管的影响

Ig-E可与血液中的肥大细胞结合，进而对肥大细胞进行调节作用，主要是促使肥大细胞脱颗粒，这些颗粒会对附近的血管有直接作用[19]。比如动脉粥样硬化患者病变处肥大细胞和Ig-E增加[20]。因此，Ig-E含量的上升说明血管受到一定的损伤。D2D是纤溶酶溶解时产生的交联纤维蛋白凝块，D2D含量升高，会导致血栓形成及血管各部位的严重出血。研究发现，冠心病患者的D2D含量均高于正常人[21]。sICAM-1是一种重要的表面粘附分子，属免疫球蛋白超家族，sICAM-1可诱导细胞发生增殖和迁移，激活T淋巴细胞，继而影响斑块的稳定性，导致斑块破裂，直接影响心血管疾病的发生率。研究发现，sICAM-1的含量越低，其心血管疾病发生率越低[22]。TM是一种糖蛋白，存在于血管内皮细胞表面，具有抗凝的作用，TM水平可以反应冠心病患者血管内皮细胞损伤的严重程度,许武红等[23]指出TM是心血管疾病危险因素的标志物。因此，本实验选用Ig-E、D2D、sICAM-1和TM作为指标来评价nano-TiO2暴露对小鼠血管的影响。

2.5.3 VE对nano-TiO2暴露后小鼠脑和血管的影响

VE具有抗氧化功能，因此本实验中使用 VE 作为一种保护剂。对100 mg·kg-1和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组添加保护剂VE，与100 mg·kg-1和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露组相比，VE可以降低脑组织氧化应激、炎症反应，并对血管有一定的保护作用。因此，VE对nano-TiO2对脑和血管系统造成的损伤具有一定的缓解作用。

3 结论

利用nano-TiO2对小鼠皮肤涂抹42 d，并使用VE 作为一种保护剂，考察nano-TiO2对小鼠大脑毒性和血管的损伤作用。结果表明，低剂量(4 mg·kg-1和20 mg·kg-1)的nano-TiO2对小鼠的大脑毒性和血管损伤较低，较高剂量(100 mg·kg-1和500 mg·kg-1)的nano-TiO2才对小鼠的大脑毒性和血管损伤明显，VE对nano-TiO2对脑和血管系统造成的损伤具有一定的缓解作用,证明nano-TiO2对心脑血管的毒性作用至少部分来源于氧化损伤。因此，长期暴露nano-TiO2有可能对人体造成损害，后续还需进一步研究长期暴露nano-TiO2对小鼠大脑和血管的影响，以充分地对化妆品中的nano-TiO2的安全性进行评估。

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The Toxicity of Nano-TiO2on Brain and Blood Vessel of Mice by Dermal Exposure

GUO Qing，LIU Zhi-min，LI Xiao-xiao,ZHAO Yun，SHEN Shi-ping，CAI Jie，YUAN Jun-lin，YANG Xu，LI Rui

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,CollegeofLifeScience,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China)

Toinvestigatetoxiceffectsofnano-TiO2onbrainandbloodvesselofmice,56BALB/cmicewererandomlydividedinto8groups,includingcontrol,solventcontrol,4mg·kg-1nano-TiO2,20mg·kg-1nano-TiO2,100mg·kg-1nano-TiO2,500mg·kg-1nano-TiO2,100mg·kg-1VE+100mg·kg-1nano-TiO2and100mg·kg-1VE+500mg·kg-1nano-TiO2,with7miceineachgroup.Micewerecontinuouslyexposedtonano-TiO2bydermalexposurefor42days.Theresultsshowedthat,thebrainandbloodvesselofmicein4mg·kg-1nano-TiO2and20mg·kg-1nano-TiO2groupswereslightlydamaged,whileobviouslydamagedin100mg·kg-1nano-TiO2and500mg·kg-1nano-TiO2groups，andvitaminEcouldrelievethatinjurytoacertainextent.Thisstudyshowednano-TiO2hadtoxiceffectsonbrainandbloodofmicebydermalexposureatadoseofnano-TiO2andoxidativedamagemightbeoneofthereasons.

nano-TiO2；toxicity；mice；dermalexposure

国家自然科学基金重点项目(21577045)

2016-07-02

郭晴(1989-),女,河南南阳人,硕士研究生,研究方向：生物化学与分子生物学,E-mail:295100071@qq.com;通讯作者：李睿，副教授,E-mail:ruili@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.003

郭晴，刘志敏，李潇潇，等.纳米二氧化钛皮肤暴露对小鼠脑和血管的毒性研究[J].化学与生物工程，2016，33(11)：15-20,26.

R 114

A

1672-5425(2016)11-0015-06