核壳型单磷酸腺苷分子印迹聚合物的制备

龚 霞，胡莹莹，尤祥宇，谷 晶，邓教宇，谢卫红

(1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068;

2.中国科学院武汉病毒研究所 中国科学院农业与环境微生物学重点实验室，湖北 武汉 430071)



核壳型单磷酸腺苷分子印迹聚合物的制备

龚 霞1，胡莹莹1，尤祥宇1，谷 晶2，邓教宇2，谢卫红1

(1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068;

2.中国科学院武汉病毒研究所 中国科学院农业与环境微生物学重点实验室，湖北 武汉 430071)

以聚苯乙烯微球(CP)为内核、单磷酸腺苷(AMP)为模板、丙烯酰胺(AM)为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，制备了核壳型单磷酸腺苷分子印迹聚合物(AMP-MIP)，讨论了不同洗脱方式、洗脱溶剂和聚合时间对AMP-MIP吸附性能的影响，通过扫描电镜、水中悬浮实验和吸附实验对AMP-MIP的形貌和性能进行了表征，得到最佳工艺条件：洗脱方式为超声、洗脱溶剂为甲醇-乙酸(4∶1，体积比)、聚合时间为30 min。分子印迹聚合物不仅对小分子模板有吸附作用，而且对大分子ADP-核糖基化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)具有识别作用，吸附量可达3.9μg·mg-1。

聚苯乙烯;单磷酸腺苷;核壳聚合;分子印迹技术;甘油醛-3-磷酸脱氢酶

ADP-核糖基化是一种蛋白质的翻译后修饰过程。研究发现，ADP-核糖基化蛋白质参与多种细胞活动[1-3]，如DNA修复、转录、翻译、细胞信号传导和细胞凋亡，还与癌症、糖尿病、神经退行性疾病、心力衰竭等疾病[4-10]有关，是临床诊断的标志物。常规检测这类蛋白质主要是应用以酶或抗体为接受器的生物传感器，这类天然生物分子往往价格昂贵、处理复杂。而分子印迹聚合物(MIP)能够模拟天然生物分子的识别作用，是生物分子的潜在替代物。与天然生物分子相比，MIP在高或低的pH值、温度、压强时较稳定，制备简单，能在有机溶剂中操作，可抗生物腐败，储存时间更长，更稳定，可重复利用。

MIP的制备分为3步：(1)在合适的分散介质中，将模板分子与合适的功能单体混合，依靠官能团之间的共价键或非共价键结合形成复合物；(2)加入适当的致孔剂、交联剂和引发剂，在热或光的作用下，形成高度交联的聚合物，而在空间排列和空间定向上，功能基团被固定；(3)通过化学或物理方法，洗脱模板分子，这样就在MIP中留下一个在空间构象和功能基团上与模板分子相匹配的三维空穴。当与模板分子重新结合时，MIP对模板分子具有专一性、特异性的识别作用。分子印迹技术已在膜分离、仿生传感器[11-12]、模拟酶[13]、选择性催化、固相萃取和色谱分离等方面取得了极大的进步，并且应用于食品安全分析[14-16]、制药工业[17-20]、环境监测和疾病诊断上。

作者以带有双硫酯基团的聚苯乙烯微球(CP)为内核、单磷酸腺苷(AMP)为模板、丙烯酰胺(AM)为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，采用可逆加成-断裂链转移自由基聚合法(RAFT)制备了核壳型单磷酸腺苷分子印迹聚合物AMP-MIP(图1)，拟为大分子蛋白质的识别和富集提供一个新的策略。

图1 核壳型分子印迹聚合物的合成路线

1 实验

1.1 试剂与仪器

单磷酸腺苷(AMP)、偶氮二异丁腈(AIBN，纯度99%)，上海源叶生物科技有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，纯度98%)，Sigma公司；二乙基二硫代氨基甲酸苄酯(BDC)，分析纯，武汉大学；丙烯酰胺(AM)、苯乙烯、二甲亚砜(DMSO)、乙腈、甲醇、乙酸均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

JSM-6390LV型扫描电子显微镜，日本电子株式会社；UV-Lambda 35型紫外可见分光光度计，Perkin-Elmer公司；VP30型真空抽滤泵，北京莱伯泰科仪器公司；G:BOX Chemi XL1.4型凝胶成像系统，基因有限公司。

1.2 聚苯乙烯微球(CP)的制备

向圆底烧瓶中加入200 mL乙腈，向其中加入一定量的聚合单体苯乙烯、交联剂EGDMA、链转移剂BDC和引发剂AIBN，在磁力搅拌器上搅拌几分钟，再超声混匀。反应体系抽真空完毕后，置于70 ℃油浴锅中加热反应4 h后，停止加热，快速取出圆底烧瓶，浸入冰水浴冷却至室温。反应液真空抽滤，用50 mL甲醇洗涤白色粉末。反复洗涤5次后，于50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得带双硫酯基团的聚苯乙烯微球(CP)。

1.3 单磷酸腺苷分子印迹聚合物(AMP-MIP)的制备

1.3.1 模板洗脱方式的优化

称取模板AMP 604.2 mg、功能单体AM 123.7 mg、CP 180.0 mg置于样品瓶中，加入25 mL致孔剂DMSO，超声混匀。在30 ℃的水浴锅中搅拌30 min后，再加入交联剂EGDMA 1.310 mL、引发剂AIBN 4.2 mg、DMSO 25 mL，再次超声混匀。将上述混合液分装在4支小试管中，用真空抽滤泵抽真空12 min。将小试管置于65 ℃油浴锅中，反应30 min。浸入冰水浴冷却至室温，抽滤，收集聚合物，均分为3份，加入50 mL甲醇-乙酸(9∶1，体积比)，第一份在磁力搅拌器上搅拌洗脱，第二份超声洗脱，第三份索氏提取洗脱。直至UV检测上清液在258 nm处无吸收峰，再用50 mL去离子水洗涤一次，最后用50 mL甲醇洗涤一次，真空干燥，得AMP-MIP。

非分子印迹聚合物(NIP)制备除了不加模板AMP外，其它步骤一样。

1.3.2 模板洗脱试剂的优化

将1.3.1所制备聚合物按表1所示洗脱试剂进行模板洗脱。

表1 模板洗脱试剂的优化

1.3.3 聚合时间的优化

按1.3.1步骤制备AMP-MIP和NIP，聚合时间分别为30 min、45 min和60 min，采用超声方式进行洗脱。

表2 聚合时间的优化

1.4 AMP-MIP的表征

1.4.1 不同洗脱条件下聚合物对AMP的吸附

用去离子水配制8μg·mL-1AMP溶液。称取不同洗脱条件得到的AMP-MIP、 NIP各20 mg于离心管中。加入1 mL 8μg·mL-1AMP溶液，超声，使其混合均匀。将离心管放置在恒温摇床中，温度设置为25 ℃，转速为200 r·min-1，振荡16 h后，12 000 r·min-1离心15 min。取上清液，0.45μm水相滤膜过滤。紫外可见分光光度计扫描，读取258 nm处吸光值，做平行实验3次。根据吸附前后溶液中AMP溶液浓度的变化，计算聚合物对模板分子AMP的吸附率和结合量：

式中：c0为模板原始浓度，μg·mL-1；c1为上清液中模板浓度，μg·mL-1；V为溶液体积，mL；m为聚合物微球质量，mg。

1.4.2 不同聚合时间下聚合物的悬浮性能

分别用去离子水配制2 mL浓度为2 mg·mL-1AMP-MIP和NIP的悬浮液，超声，使聚合物充分分散悬浮。以黑板子为背景，按聚合时间顺序排列。室温下静置，分时间段进行拍照。

1.4.3 不同聚合时间下聚合物的形貌表征

取一定量的聚合物，先用乙醇溶解，超声混匀，将溶液滴在锡箔纸上，在空气中干燥后，用扫描电镜观察其形貌。

1.4.4 不同聚合时间下聚合物对gapA的吸附性能

称取1.3.3中所制备的3组AMP-MIP和NIP各10 mg于离心管中，用pH=7.5的50 mmol·L-1Tris-HCl对gapA进行稀释，向离心管中加入0.5 mL一定浓度的gapA溶液，混合均匀。孵育16 h后，离心收集上清液，进行SDS-PAGE。使用凝胶成像系统拍照，用Genetools半定量分析，以0.2 mg·mL-1BSA为标准量，定量上清液浓度。根据吸附前后溶液中gapA溶液浓度的变化，计算聚合物对蛋白质的结合量。

2 结果与讨论

2.1 AMP-MIP的洗脱条件优化

2.1.1 洗脱方式优化(图2)

图2 不同洗脱方式下聚合物对AMP的结合量

从图2可以看出，超声洗脱方式所得聚合物对AMP的结合量最大，即超声洗脱方式的模板洗脱效果最好；索氏提取的次之，索氏提取比较节省溶剂，但是洗脱效率较低；搅拌洗脱方式的效果最差。因此，最佳洗脱方式为超声。

2.1.2 洗脱试剂优化(图3)

图3 不同洗脱试剂下聚合物对AMP的吸附率

模板分子与功能单体之间以非共价键相连，可以采用高极性洗脱溶剂反复萃取，将模板分子从印迹聚合物中除去。由图3可以看出，在洗脱溶剂为甲醇-乙酸(4∶1)时，AMP-MIP对AMP的吸附率最高；其它3种洗脱溶剂下，AMP-MIP的吸附率都比NIP要低。这可能是因为模板分子没有洗脱，也就是说在相同洗脱次数下，洗脱溶剂为甲醇-乙酸(4∶1)的洗脱效率最高，效果最好。

2.2 AMP-MIP的聚合时间优化

2.2.1 水中悬浮实验(图4)

样品从左到右依次为CP、M1、N1、M2、N2、M3、N3

从图4可知，所有的聚合物比CP内核沉淀的更快，说明印迹壳层已经修饰上去。随着聚合时间的延长，聚合物在水中的稳定性越来越差，亲水性越来越低。从沉降到瓶底聚合物的厚度可知，聚合物之间形成了一种支撑骨架。综上，当聚合时间为30 min时，聚合物在水中有更好的稳定性。

2.2.2 SEM分析(图5)

图5 不同聚合物的SEM照片

由图5可知，随着聚合时间的延长，壳层会越来越厚，聚合物越来越不均一。这主要是由于内核表面在进行RAFT反应，内核表面的双硫酯基团使聚合反应活性可控，反应相对较慢，同时游离在溶剂里的化合物也在进行不可控聚合反应，当溶液中的低聚物慢慢增多至形成一定大小交联度的颗粒，溶液稠度增大，游离的聚合物会将核壳型聚合物交联起来，形成粒径变大、不均一的颗粒。从聚合物M3、N3的扫描电镜照片可以看出，核壳型聚合物之间确实交联起来了，聚合物粒径过大，重力变大，也说明了水中聚合物稳定性变差的原因。

2.2.3 AMP-MIP对gapA的吸附

不同聚合时间下AMP-MIP、NIP对gapA吸附凝胶成像如图6所示。

图6 不同聚合时间下AMP-MIP、NIP对gapA的吸附凝胶成像

从图6可知，随着聚合时间的延长，AMP-MIP和NIP对目标蛋白gapA的结合量越来越少，同时印迹指数α值也在慢慢变小。不同聚合时间下AMP-MIP、NIP对gapA的结合量见图7。

图7 不同聚合时间下AMP-MIP、NIP对gapA的结合量

由图7可知，当聚合时间为30 min时，AMP-MIP对ADP-核糖基化蛋白质的特异性结合效果最好，结合量达3.9μg·mL-1，聚合时间越长，结合效果越差。这主要是因为，聚合时间延长，核壳型微球相互交联，导致颗粒变大，影响了聚合物在水中的稳定性和亲水性能，而且聚合物比表面积减小，对蛋白质的特异性结合量也会变小。所以，选择聚合时间为30 min。

3 结论

以聚苯乙烯微球(CP)为内核、单磷酸腺苷(AMP)为模板、丙烯酰胺(AM)为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，制备了核壳型单磷酸腺苷分子印迹聚合物(AMP-MIP)。通过扫描电镜、水中悬浮实验和吸附实验对AMP-MIP的形貌和性能进行了表征，得到最佳工艺条件：洗脱方式为超声、洗脱溶剂为甲醇-乙酸(4∶1)、聚合时间为30 min。分子印迹聚合物不仅对小分子模板有吸附作用，而且对大分子ADP-核糖基化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)具有识别作用，吸附量可达3.9 μg·mg-1。

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Preparation of Core-Shell Adenosine-5′-Monophosphate Molecularly Imprinted Polymer

GONG Xia1,HU Ying-ying1,YOU Xiang-yu1,GU Jing2,DENG Jiao-yu2,XIE Wei-hong1

(1.InstituteofBioengineeringandFood,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan430068，China；2.TheStateKeyLaboratoryofAgriculturalandEnvironmentalMicrobiologyofCAS,WuhanInstituteofVirology,CAS,Wuhan430071,China)

Usingpolystyrenemicrosphere(CP)asacore,adenosine-5′-monophosphate(AMP)asatemplate,acrylamide(AM)asafunctionalmonomerandethyleneglycoldimethacrylate(EGDMA)asacross-linker,whiledimethylsulfoxide(DMSO)waschosenasaporogenandazobisisobutyronitrile(AIBN)asaninitiator,core-shelladenosine-5′-monophosphatemolecularimprintedpolymer(AMP-MIP)wasprepared.Theeffectsofdifferentelutionmethods,solventsandpolymerizationtimeonthepropertiesofAMP-MIPrecognitionwerediscussed.ThemorphologyandpropertyofAMP-MIPwerecharacterizedbySEM,thesuspensioninaqueousmediumandthebindingexperiments.Theoptimalprocessconditionswereobtainedasfollows:theelutionmethodwasultrasound,theelutionsolventwasmethanol-aceticacid(4∶1)andpolymerizationtimewas30min.AMP-MIPshowedgoodselectivitiesnotonlyforAMPbutalsoforglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(gapA)whichwasADP-ribosylatedprotein.TheadsorptioncapacityofgapAcouldreach3.9 μg·mg-1.

polystyrene;adenosine-5′-monophosphate;core-shellpolymerization;molecularlyimprintingtechnology;glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase

中国科学院病毒研究所国家重点实验室开放研究基金(20875024)

2016-06-06

龚霞(1990-)，女，湖北荆门人，硕士研究生，研究方向：分子印迹材料，E-mail:gongxia824@126.com;通讯作者：谢卫红，博士，教授，E-mail:weihong.xie@mail.hbut.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.005

龚霞，胡莹莹，尤祥宇，等.核壳型单磷酸腺苷分子印迹聚合物的制备[J].化学与生物工程，2016，33(11)：27-31.

TQ 317

A

1672-5425(2016)11-0027-05