直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂对葡萄酒品质的影响

李莹莹，苏 静，杨世玲，张 宇，李 华

(西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100)



直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂对葡萄酒品质的影响

李莹莹，苏 静，杨世玲，张 宇，李 华

(西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 研究直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂进行苹果酸-乳酸发酵(MLF)对葡萄酒品质的影响，并与商业MLF发酵剂Viniflora®Oenos进行比较。【方法】 将4 ℃保存的SD-2a和Viniflora®Oenos发酵剂置于室温30 min后，均以10 mg/L的接种量直接投入到赤霞珠干红葡萄酒中，于20℃进行 MLF，发酵结束后立即加入60 mg/L SO2终止发酵，将发酵后的葡萄酒分别标记为MLF-1和MLF-2，以发酵前的赤霞珠干红葡萄酒为对照(CK)，每处理重复3次。然后采用高效液相色谱法(HPLC)和气质联用法(GC-MS)分别测定CK、MLF-1及MLF-2中的花色苷和挥发性成分，并进行感官分析。【结果】 与CK相比，采用SD-2a和Viniflora®Oenos发酵剂进行MLF都能显著提高葡萄酒的品质。MLF-1发酵时间为24 d，MLF-2发酵时间为20 d；CK、MLF-1、MLF-2总花色苷质量浓度分别为 78.51，49.60，55.60 mg/L，挥发性物质质量浓度分别为12.30，15.84，15.58 mg/L，感官品评得分分别为68.7，74.6，74.9。【结论】 直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂的MLF性能良好，具有开发商业乳酸菌发酵剂的巨大潜力。

直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂；苹果酸-乳酸发酵；葡萄酒品质

苹果酸-乳酸发酵(MLF)是葡萄酒在酒精发酵(AF)结束后，乳酸菌将苹果酸分解为乳酸和CO2的过程[1]。MLF也被称为二次发酵，它能改善葡萄酒的化学成分和感官特性，在葡萄酒酿造中具有非常重要的作用[2-3]。在适宜的条件中，葡萄酒MLF可以自发进行，但是自发的MLF难以控制，发酵时间长且葡萄酒会有变质的风险。随着商业MLF发酵剂的问世，更多的酒厂选择使用商业发酵剂进行MLF，不仅发酵速度快、易于控制，且对葡萄酒风味影响较大，发酵后的葡萄酒品质有很大的提升[4]。细菌接种葡萄酒后的生长情况以及完成MLF的时间会受各种因素影响，例如葡萄酒理化参数、能源物质及其他微生物[5]。因此，用于生产发酵剂的菌株必须经过严格的筛选过程[6]。使用本土葡萄酒中筛选出的LAB菌株作为MLF发酵剂有一定优势，不仅菌株对葡萄酒条件具有天然的适应性，同时还可以充分保留区域葡萄酒的特点[7]。

葡萄酒感官品质主要体现在颜色、香气及口感上，而颜色和香气品质对消费者的认可与选择会产生重要影响。葡萄酒颜色的深浅主要是由其中花色苷种类和含量决定。葡萄酒的香气主要取决于挥发性呈香物质，这些物质在不同葡萄酒中的种类和含量均有差异，它们相互作用达到平衡，最终形成葡萄酒特有的香气。目前，对葡萄酒品质分析主要采用仪器分析和感官品尝相结合的方法，仪器分析不仅可以定性定量分析检测样品，而且具有很好的重复性和不受主观因素影响的优点，这使得仪器分析成为葡萄酒品质评价的有力工具[8]；而感官品尝是葡萄酒感官品质评价的基础，是目前任何仪器分析所不能替代的。此外，对发酵剂菌株的筛选要求除了能够代谢苹果酸外，还必须能够给予葡萄酒令人满意的感官特性，然而不同菌株对于葡萄酒感官组分的形成具有差异性[9]，因此筛选MLF发酵剂时也需要对其所发酵葡萄酒的感官品质进行评价。为了揭示葡萄酒乳酸菌菌株对葡萄酒品质的影响机理，进而生产优良的MLF发酵剂，还需要进行更深入的研究[10]。

目前，我国葡萄酒生产中使用的乳酸菌发酵剂全部依赖进口，国内没有相应的生产厂家。酒酒球菌SD-2a是由西北农林科技大学葡萄酒学院选育的一株发酵性能较好的菌株，制成干粉后活性高，具有用于开发直投式葡萄酒乳酸菌发酵剂的潜力。本研究采用酒酒球菌SD-2a活性干粉和进口商业乳酸菌直投葡萄酒进行MLF，利用高效液相色谱(HPLC)和气质联用技术(GC-MS)对发酵前后葡萄酒中的花色苷和香气成分进行检测，并对发酵前后的葡萄酒进行感官品评，为直投式酒酒球菌SD-2a活性干粉的商业开发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验菌株与供试原酒 酒酒球菌SD-2a活性干粉，按照黄科[11]和张如金[12]的方法进行制备；Viniflora®Oenos直投式活性干粉，为丹麦CHR HANSEN 公司产品。MLF前酒样为2014年经酒精发酵后的赤霞珠(Cabernet Sauvignon)干红葡萄酒，由西北农林科技大学葡萄酒学院提供，其pH和酒精度(V/V)分别为3.40和12.70%。

1.1.2 仪器与设备 PHS-3C型pH计，上海雷磁；AUY220型电子分析天平，日本岛津；LC-20A型液相色谱仪，日本岛津；TRACE DSQ型气相色谱-质谱联用仪，美国赛默飞世尔。

1.2 试验方法

将保存在4 ℃条件下的SD-2a和Viniflora®Oenos活性干粉取出，放置于室温30 min。2种干粉均以10 mg/L的接种量直接投入到赤霞珠干红葡萄酒中进行MLF，发酵温度为20 ℃。发酵后的葡萄酒分别标记为MLF-1和MLF-2，以发酵前的赤霞珠干红葡萄酒为对照(CK)。采用纸层析法对MLF进程进行监控，发酵结束后立即加入60 mg/L SO2终止发酵。分别对CK、MLF-1以及MLF-2中的花色苷和挥发性物质进行测定，并进行葡萄酒感官品尝分析。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 MLF时间 MLF时间的监测采用纸层析法。层析纸选用新华No.3色层定性分析滤纸,展开剂是质量分数为0.1%的溴酚蓝的正丁醇溶液与体积分数为50%的醋酸以2∶1的体积比混合。当层析纸上出现乳酸色斑认为MLF已经启动，当苹果酸色斑消失认为MLF已经完成，期间经历的时间为MLF时间。

1.3.2 葡萄酒基本理化指标 葡萄酒基本理化指标测定参考《葡萄酒分析检验》[13]进行。

1.3.3 花色苷质量浓度 花色苷质量浓度的测定参照王贞强等[14]的高效液相色谱法(HPLC)进行。

1.3.4 挥发性物质质量浓度 挥发性物质质量浓度的测定参照杨丽丽等[15]的气质联用法(GC-MS)进行。

1.3.5 葡萄酒感官分析 葡萄酒感官分析采用分级品尝方法[16]。品尝小组由16名经过专业训练的学生组成。在25 ℃自然采光的品尝室，酒样品尝时间间隔为5 min，品尝项目及评分标准见表1。

表 1 葡萄酒品尝项目及其评分标准

1.4 数据处理

用EXCEL 2013和 IBM SPSS Statistics 20软件对数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 MLF时间及MLF前后葡萄酒总酸、挥发酸和pH值的变化

MLF时间及MLF前后葡萄酒pH值、总酸、挥发酸的测定结果如表2所示。表2显示，SD-2a活性干粉能在第24天完成MLF，比商业干粉完成发酵的时间晚4 d。与CK相比，经过MLF的葡萄酒的pH值分别升高了0.13(MLF-1)和0.12(MLF-2)，总酸分别降低了1.71 g/L(MLF-1)和1.66 g/L(MLF-2)，挥发酸分别升高了0.39 g/L(MLF-1)和0.36 g/L(MLF-2)。

表 2 MLF时间及MLF前后葡萄酒总酸、挥发酸和pH值的变化

2.2 MLF前后葡萄酒中花色苷质量浓度的变化

MLF前后葡萄酒中单体花色苷质量浓度的变化如表3所示。表3显示，与CK相比，MLF后的葡萄酒中单体花色苷和总花色苷质量浓度均显著下降(P<0.05)，但MLF-1和MLF-2中的9种单体花色苷质量浓度的下降程度并不同。MLF-2中二甲花翠素3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷和总花色苷的质量浓度均显著高于MLF-1(P<0.05)。MLF后花色苷质量浓度下降是因为在MLF过程中葡萄酒的总酸下降、pH值上升，从而导致葡萄酒色调由鲜红色向带蓝色色调的红色转变。此外，丙酮酸、α-酮戊二酸等物质在葡萄酒中与SO2相结合，然而葡萄酒中的乳酸菌可以利用这些物质，从而导致SO2的释放。所释放的SO2可以与花色苷结合引起葡萄酒色度降低，使葡萄酒色调更趋向于成熟葡萄酒的色调[17]。另外，MLF可以降低葡萄酒中总酚、儿茶素、花色素等的含量，影响葡萄酒中不同花色素的比例，从而导致葡萄酒色素类物质发生物理及化学变化，进而使葡萄酒色度发生改变[18]。在本研究所测定的9种花色苷中，二甲花翠素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷质量浓度均较高，分别约占总花色苷质量浓度的60%和20%，其在葡萄酒的花色苷组成中占据着重要地位[19]。红葡萄酒的颜色深浅主要取决于葡萄皮中的花色苷含量[20-21]。酒酒球菌可以影响红葡萄酒呈色物质的质量浓度，如乙醛[22]和丙酮酸[23]，经过MLF后葡萄酒的花色苷质量浓度减少，颜色更浅[24]。但也有研究发现，MLF后葡萄酒色度只有轻微的变化，对花色苷质量浓度的影响并不明显[25]。

表 3 MLF前后葡萄酒中花色苷种类及其质量浓度

注:同行数据后标不同小写字母表示不同样品间差异显著(P<0.05)。

Note:Values with different lowercase letters in each line represent significant difference among treatments atP<0.05.

2.3 MLF前后葡萄酒香气的变化

2.3.1 GC-MS总离子图 葡萄酒样品通过搅拌、萃取，上样，所得的CK、MLF-1及MLF-2挥发性组分的GC-MS总离子图见图1，各组分质谱经计算机谱库(NIST02版本)检索及资料分析，共鉴定出了45种挥发性物质。统计葡萄酒中挥发性物质相对含量发现，CK、MLF-1及MLF-2中的酯类相对含量分别为23.52%，31.00%，33.33%；醇类相对含量分别为43.65%，42.81%，41.54%；酸类相对含量分别为31.67%，25.31%，24.50%。可知MLF后，葡萄酒中酯类物质含量升高，酸类物质含量下降。

2.3.2 挥发性物质 葡萄酒MLF前后各种挥发性物质的质量浓度如表4所示。由表4可知，葡萄酒中的挥发性物质主要包括酯类、醇类、酸类、酚类、萜烯类及酮醛类。在所有的挥发性物质中质量浓度最高的是醇类，其次是酸类和酯类物质，酚类和萜烯类以及醛酮类物质较少。CK中挥发性物质总质量浓度为12.30 mg/L，发酵后的葡萄酒中挥发性物质质量浓度分别为15.84 mg/L(MLF-1)和15.58 mg/L(MLF-2)。葡萄酒在MLF后挥发性物质种类和质量浓度都有不同程度的升高。MLF后出现的新物质有乙酸乙酯(微带果香的酒香)、2-甲基丁酸乙酯(水果香味)、辛酸甲酯(菠萝香味)、丁酸二乙酯、辛酸二乙酯、1-癸醇(花香和果香)。

表4显示，与CK相比，MLF-1和MLF-2中酯类和醇类物质质量浓度都有明显增加，且MLF-1中酯类和醇类物质的增加量均多于MLF-2；MLF-1中酸类物质质量浓度也都有明显的升高，而酚类及萜烯类物质质量浓度有所下降，醛酮类物质质量浓度无明显变化；MLF-2中酸类物质、酚类及萜烯类物质和醛酮类物质质量浓度都有所下降。

2.3.3 香气成分 众所周知，葡萄酒乳酸菌可以对葡萄酒香气和风味进行修饰，其机制为①乳酸菌可以代谢葡萄酒组分产生挥发性物质，②乳酸菌可以对来自葡萄和酵母的二次代谢物进行修饰，③乳酸菌可以对细胞壁或香气组分进行吸收代谢。MLF后的葡萄酒通常具有奶油味、坚果味、香草味、果香、植物性香气、烤面包及皮革味[26]。图2是葡萄酒MLF前后挥发性物质主成分分析(PCA)的结果，前2个主成分的累积影响作用为100%，主成分1和主成分2分别代表了所有香气成分的75.41%和24.59%。由图2可知，3个酒样的主要挥发性物质差异较大。CK位于横轴约-1.0处，主要挥发性物质有丁酸乙酯(水果香味)，己酸乙酯(苹果、香蕉气味)，辛酸乙酯(青果香气)，琥珀酸二乙酯(甜橙香气)，苯乙醇乙酸酯(无臭、味微苦)，正辛醇(芳香气味)，9-癸烯酸(果香和乳香)，反式橙花叔醇(橙花气息)。MLF-1位于第一象限，主要挥发性物质有乙酸乙酯(清灵、微带果香的酒香)，2-甲基丙酸乙酯(香蕉、菠萝味)，乙酸异丁酯(菠萝香味)，2-甲基丁酸乙酯(水果香味)，庚酸乙酯(菠萝香气)，2-己烯酸乙酯(白兰地酒香)，癸酸乙酯(香料味)，水杨酸甲酯(有梨香、皮革味)，苯乙酸乙酯(药草特殊气味、味甜)，1-癸醇(花香和果香)，苯乙醇(清甜的玫瑰样花香)，橙花醇(玫瑰香气)，大马士酮(强烈的类似玫瑰的芳香)。MLF-2位于第四象限，主要挥发性物质有2-甲基丁酸乙酯(水果香味)，丙酸乙酯(菠萝香味)，1-癸醇(花香和果香)，辛酸甲酯(菠萝香味)，9-癸烯酸乙酯(有愉快气味)，丁酸二乙酯(有特殊气味)，2-己烯酸乙酯(白兰地酒香)，庚醇(有特殊臭味)，己酸(肉香)，2-辛酮(牛奶味、乳酪味)。

图 1 MLF前后葡萄酒中挥发性组分的GC-MS总离子图

表 4 MLF前后葡萄酒中挥发性物质质量浓度的变化

表 4(续) Continued talbe 4

总体而言，CK的主要香气以果香为主，微带花香和乳香。MLF-1中香气种类及其质量浓度比较多，主要香气以果香和花香为主，另外还有白兰地酒香、香料味、皮革味、药草味、蜂蜜味、奶油味，表明酒酒球菌SD-2a进行MLF极大地提高了葡萄酒的香气复杂度。MLF-2中香气也是以果香和花香为主，此外还有白兰地酒香、肉香以及奶香，也在一定程度上提高了葡萄酒的香气复杂度。MLF后葡萄酒的香气物质质量浓度及复杂性增加[27]，且MLF-1的香气复杂度高于MLF-2。

2.4 MLF前后葡萄酒感官品尝结果

由表5可知，经过MLF之后，葡萄酒的整体品质都有了不同程度的提升。原酒的品评得分为68.7，而SD-2a干粉和商业干粉发酵后的葡萄酒品评得分分别为74.6和74.9。

与CK相比，MLF后的葡萄酒香气纯正度、香气浓度、口感浓度、口感持久性、口感品质以及整体平衡性都有一定提升，而澄清度、色调、香气品质以及口感纯正度上没有明显变化。MLF-1在颜色以及香气上不及MLF-2，但是口感和整体平衡性上均优于MLF-2。Jeromel等[28]的研究发现，MLF后的葡萄酒与未进行MLF的相比口感更加圆润和丰满。这也与Herjavec等[29]认为没有进行MLF的葡萄酒品质不如接种发酵或自然发酵后的葡萄酒的结论相一致。这是因为，除了降酸，乳酸菌还可以在MLF中代谢葡萄酒中的其他前体物质，改变葡萄酒的化学组分，进而增加葡萄酒香气和风味的复杂度。

1.乙酸乙酯 Ethyl acetate；2.丙酸乙酯 Ethyl propionate；3.2-甲基丙酸乙酯 Ethyl-2-methylpropanoate；4.乙酸异丁酯 Acetic acid isobutyl ester；5.丁酸乙酯 Ethyl butyrate；6.2-甲基丁酸乙酯 Ethyl-2-Methylbutyrate；7.3-甲基丁酸乙酯 Ethyl-3-Methylbutyrate；8.己酸乙酯 Ethyl hexanoate；9.庚酸乙酯 Ethyl oenanthate；10.2-己烯酸乙酯 2-Hexenoic acid ethyl ester；11.辛酸甲酯 Methyl octanoate；12.辛酸乙酯 Etheyl Octanoat；13.癸酸乙酯 Ethyl caprate；14.琥珀酸二乙酯 Dimethyl succinate；15.9-癸烯酸乙酯 9-Decenoic acid ethyl ester；16.水杨酸甲酯 Methyl salicylate；17.苯乙酸乙酯 Ethyl phenylacetate；18.3,4-二羟基苯甲酸乙酯 Ethyl 3,4-Dihydroxybenzoate；19.苯乙醇乙酸酯 Phenethyl acetate；20.丁酸二乙酯 Diethyl succinate；21.辛酸二乙酯 Diethyl suberate；22.2,5-二羟基苯甲酸甲酯 Methyl 2,5-dihydroxybenzoate；23.琥珀酸单乙酯 Monoethyl succinate；24.δ-十二烷醇内酯 δ-Dodecalactone；25.甲基丙烯酸丙酯 n-Propyl methacrylate；26.3-甲基-1-丁醇 Isoamylalcohol；27.庚醇 Oenanthol；28.正辛醇 Octanol；29.(Z)-6-壬烯-1-醇 cis-6-nonen-1-ol；30.1-癸醇 Decyl alcohol；31.苯乙醇 Phenethyl alcohol；32.己酸 Caproic acid；33.辛酸 Octanoic acid；34.正癸酸 Capric acid；35.9-癸烯酸 9-Decenoicacid；36.月桂酸 Lauric acid；37.十六酸 Palmitic acid；38.棕榈油酸 9-hexadecenoic acid；39.3,4,5-三甲氧基苯乙酸 3,4,5-Trimethoxyphenylaceticacid；40.橙花醇 Nerol；41.反式橙花叔醇 Nerolidol；42.2-辛酮 2-Octanone；43.大马士酮(E)-1-(2,6,6-Trimethyl-1,3-cyclohexadien-1-yl)-2-buten-1-one

图 2 葡萄酒MLF前后挥发性物质的主成分分析(PCA)

Fig.2 Principal content analysis of wine volatile compounds before and after MLF

表 5 葡萄酒MLF前后感官品尝的得分比较

注：采用100分制：完美.总分>86；很好.总分>80～≤86；好.总分>70～≤80；一般.总分>50～≤70；不好.总分≤50。

Note：Excellent.Total score>86;Very good.Total score>80-≤86;Good.Total score>70-≤80;Acceptable.Total score>50-≤70;Insufficient.Total score≤50.

3 讨论与结论

与未经过MLF的葡萄酒相比，经过MLF的葡萄酒总酸会下降1～3 g/L，同时pH会上升0.05～0.45，MLF后葡萄酒中酸含量的降幅主要由葡萄酒中的苹果酸含量及其与酒石酸的比例所决定[1]。除了降低葡萄酒的酸度，使口感更加圆润柔和，MLF还可以增加葡萄酒的香气复杂度，从而提高葡萄酒的整体质量[30]。本研究中，MLF后葡萄酒中酯类物质种类及其质量浓度增加，酸类物质质量浓度降低，使葡萄酒的香气趋于成熟；但是MLF会在一定程度上降低葡萄酒中花色苷的质量浓度，从而影响葡萄酒的色度。这是由于乳酸菌的生理代谢活动使得葡萄酒中花色苷的质量浓度和比例发生了一些改变。另外，pH的升高也会对葡萄酒的颜色产生影响。也有研究发现MLF后葡萄酒的色度出现升高的现象[31]，这可能与乳酸菌菌株以及原酒酿造工艺有关。

综上所述，利用直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂进行苹果酸-乳酸发酵时，所得葡萄酒样MLF-1较MLF-2晚4 d完成发酵。SD-2a干粉发酵后的葡萄酒MLF-1中总花色苷质量浓度(49.60 mg/L)低于MLF-2(55.60 mg/L)，但二者挥发性物质总质量浓度(15.84和15.58 mg/L)差异不显著；与CK和MLF-2相比，SD-2a干粉发酵后的葡萄酒MLF-1香气纯正度、香气浓度、口感浓度、口感持久性、口感品质以及整体平衡性都较好，而澄清度、色调、香气品质以及口感纯正度上无明显差异。总之，酒酒球菌SD-2a活性干粉进行MLF可以显著改善葡萄酒的香气质量和感官品质，进而可以显著提高葡萄酒的整体品质。因此，酒酒球菌SD-2a在用于生产商业乳酸菌发酵剂方面具有很大潜力。

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Effect of direct vat set Oenococcus oeni SD-2a starter culture on quality of wine

LI Yingying,SU Jing,YANG Shiling,ZHANG Yu,LI Hua

(College of Enology,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100，China)

【Objective】 This study investigated the effect of malo-lactic fermentation (MLF) conducted by direct vat set (DVS)OenococcusoeniSD-2a starter culture on the quality of red wine and compared with commercial MLF starter culture (Viniflora®Oenos). 【Method】 Both the SD-2a and Viniflora®Oenos starter culture,which were preserved at 4 ℃ before being placed in room temperature for half an hour,were inoculated directly to the Cabernet Sauvignon dry red wine with the inoculum size of 10 mg/L to conduct the MLF at 20 ℃.Then,60 mg/L SO2was added to stop fermentation,and the wines were remarked as MLF-1 and MLF-2,respectively. Each treatment had three parallel repeats and the untreated Cabernet Sauvignon dry red wine was used as control.High performance liquid chromatography (HPLC) and Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS) were applied to determine the levels of anthocyanins and volatile components,while sensory analysis was used to identify the quality.【Result】 Compared with CK,usingOenococcusoeniSD-2a and Viniflora®Oenos to conduct MLF significantly improved the quality of wine.MLF-1 was conducted for 24 days and MLF-2 was conducted for 20 days.The mass concentrations of total anthocyanin in CK,MLF-1 and MLF-2 were 78.51,49.60 and 55.60 mg/L,the mass concentrations of volatile components were 12.30,15.84 and 15.58 mg/L,and the results of those in sensory tasting were 68.7,74.6,and 74.9,respectively.【Conclusion】 The performance of DVSOenococcusoeniSD-2a starter culture was good and has huge potential for the development of commercial lactic acid bacteria starter.

direct vat setOenococcusoeniSD-2a starter culture;malo-lactic fermentation;wine quality

时间:2016-10-20 16:37

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.026

2015-07-01

国家自然科学基金项目(31471708)

李莹莹(1990-),女,河南商丘人,硕士,主要从事酿酒微生物研究。

李 华(1959-),男,重庆梁平人，教授,博士,博士生导师,主要从事葡萄与葡萄酒研究。 E-mail：lihuawine@nwsuaf.edu.cn

S663.1

A

1671-9387(2016)12-0192-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161020.1637.052.html