琼脂糖胶原防粘连膜的生物相容性研究

向健 田胜慧 柯军 广东省医疗器械质量监督检验所 （广州 510080）

琼脂糖胶原防粘连膜的生物相容性研究

向健 田胜慧 柯军 广东省医疗器械质量监督检验所 （广州 510080）

目的：旨在研究琼脂糖胶原防粘连膜的生物相容性，为其临床应用提供实验依据。方法：依据GB/T16886-ISO10993相关标准，通过体外细胞毒性试验、迟发型超敏反应试验、皮内刺激试验、急性全身毒性试验、溶血试验、Ames试验、皮下植入试验来评价琼脂糖胶原防粘连膜的生物相容性。结果：琼脂糖胶原防粘连膜有轻微细胞毒性、无致敏性、无皮内刺激性、无急性全身毒性、无溶血性、无遗传毒性，皮下植入后1周和4周，局部组织有炎症反应，植入后12周，炎症反应明显减轻，植入期内可见材料缓慢降解。结论：该琼脂糖胶原防粘连膜材料具有良好的生物相容性，符合临床使用要求。

琼脂糖胶原防粘连膜 生物相容性 毒性试验

术后粘连是结缔组织纤维带与相邻组织或器官相结合而形成的异常结构，在外科领域，尤其是腹部手术中，其发生率高达93%，可引发多种严重并发症，直接影响手术效果[1]。目前，国内外防止术后粘连的方法主要有两种，一种是使用药物以减轻因局部缺血而引起的炎症并溶解纤维蛋白；另一种是利用医疗器械类防粘连膜的“短期屏障”作用，隔离在创面与周围组织之间，防止成纤维细胞入侵，从而达到预防组织粘连的效果[2]。近年来，已有多种高分子材料应用于医用防粘连膜的开发，而琼脂糖作为一种低价高质的天然高分子多糖，在防粘连领域的应用价值正受到越来越多的关注[3]。本研究中的防粘连膜以琼脂糖和胶原为主要材料制成，由于此类产品属于长期植入类医疗器械，按Ⅲ类高风险医疗器械管理，其生物相容性和降解产物安全性是药监部门的重点监测内容。因此，本研究参照GB/T16886-ISO10993医疗器械生物学评价相关标准，进行了体外细胞毒性试验、迟发型超敏反应试验、皮内反应试验、急性全身毒性试验、溶血试验、Ames试验及皮下植入试验，来评价琼脂糖胶原防粘连膜的生物相容性，为其临床上的安全使用提供实验依据。

1.材料与方法

1.1 供试品

琼脂糖胶原防粘连膜，规格为50mm×50mm ×0.07mm，呈白色膜片状，灭菌包装。

1.2 供试品浸提液制备

除体外细胞毒性试验、溶血试验和皮下植入试验，其余试验的浸提液均按供试品表面积/浸提介质为6cm2/mL的比例制备，浸提介质为0.9%氯化钠注射液，浸提条件为37°C下浸提72h。

1.3 体外细胞毒性试验

供试品按6cm2/mL的比例充入含血清培养基（1×），37°C下浸提24h制备供试液。

将已培养48h～72h生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养基，吹打混匀后在显微镜下计数。将细胞悬液配制成密度1×105/mL接种于直径35mm培养皿，每皿2mL，共12皿，置CO2培养箱37°C培养至近汇合单层细胞形成。弃去原培养液，分别加入空白对照液（同批含血清培养基（1×）37°C下放置24h）、阴性对照液（取高密度聚乙烯，用超纯水洗净晾干，紫外线照射过夜后剪碎。按表面积3cm2/mL的比例加入同批含血清培养基（1×）37°C下浸提24h）、阳性对照液（5g/L苯酚溶液）、供试液各3皿，每皿2mL，置CO2培养箱37°C培养72h后将培养皿置，显微镜下观察各组细胞的细胞形态，并进行定性评价。

1.4 迟发型超敏反应试验

试验采用普通级豚鼠15只，分为试验组和阴性对照组，试验组采用10只动物，阴性对照组采用5只动物，雌雄不限。试验前除去动物试验部位被毛，按图1做3对左右对称的注射点，每注射点皮内注射0.1mL弗氏完全佐剂（FCA）进行预处理。正式试验分为三个阶段：（1）皮内诱导阶段：按图1所示的注射部位皮内注射相应的注射液0.1mL。部位A：空白浸提介质与FCA以体积比50:50的比例制备成稳定性乳化剂。部位B：试验组注射未经稀释的浸提液；对照组注射相应溶剂。部位C：试验组浸提液以体积比50:50的比例与FCA与溶剂（50%）制备成的乳化剂；对照组注射相应介质与佐剂制备成的乳化剂。（2）局部诱导阶段：皮内诱导后7d，用面积8cm2的无菌纱布块浸透浸提液局部贴敷于每只豚鼠的肩胛骨内侧，覆盖诱导注射点。用封闭式包扎带固定，48h后除去包扎带和纱布块。同法用空白浸提介质操作对照组动物。（3）激发阶段：局部诱导后14d，用浸提液激发全部试验动物。将无菌纱布浸透浸提液，局部贴敷于豚鼠上腹部，用封闭式包扎带固定，24h后除去包扎带和纱布。同法用空白浸提介质操作对照组动物。除去贴敷纱布块后24h和48h观察试验组和对照组动物激发部位皮肤情况，按Magnusson和Kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿情况进行描述并分级评价。

1.5 皮内刺激试验

图1. 皮内注射点

试验采用普通级新西兰白兔2只，体重2.4～2.5kg，雌雄不限。试验前12h将兔背部被毛去除干净，用75%乙醇擦拭去毛区域，在背部选取10个点，每点间隔2cm，上部5个点皮内注射0.2mL供试品浸提液，下部5个点皮内注射0.2mL浸提介质。注射后24h、48h和72h观察注射局部及周围组织的反应情况（红斑、水肿、坏死等），并按标准规定进行评分。具体记分标准详见表1。

表1. 皮内刺激反应记分标准

1.6 急性全身毒性试验

试验采用SPF级KM小鼠10只，随机分为试验组和阴性对照组，每组5只，雌雄不限。试验组和阴性对照组分别尾静脉注射供试品浸提液和浸提介质，注射量为50mL/kg。注射完毕即时观察小鼠反应，并于4h、24h、48h和72h后观察两组动物的一般状态、毒性表现和死亡情况，并称量动物体重。

1.7 溶血试验

试验组：取3支试管，每管注入10mL0.9%氯化钠注射液，按6cm2/mL的比例向每支试管内加入所需样品，摇匀，覆盖全部材料。

阴性对照组：取3支试管，每支注入同批号10mL0.9%氯化钠注射液。

阳性对照组：取3支试管，每支注入10mL蒸馏水。

将试验管、阴性管、阳性管放入37°C水浴中保温30min，随后分别加入0.2mL稀释抗凝兔血，轻轻混匀，继续在37°C恒温水浴中保温60min。水浴结束后倒出管内液体，800g离心5min。取上清液置于紫外分光光度计比色皿中，在545nm处测量吸光度值，并计算各组3管的平均值。溶血程度按以下公式计算：

式中：A—供试品液吸光度；

B－阴性对照液吸光度；

C－阳性对照液吸光度。

1.8 Ames试验

取营养肉汤培养基5mL，加入无菌小三角瓶中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，在（37±1）°C、（115r/min～125 r/min）振荡培养10h～12h至对数生长期，活菌数不少于1×109/mL。融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2mL，在45°C水浴中保温。

在保温的顶层培养基中依次加入每种试验菌株新鲜菌液0.1mL，混匀；试验组加入0.1mL供试品浸提液和（或）0.05mLDMSO浸提液，每组三管。活化组再加10%S9混合液0.5mL，无活化组加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL，再混匀。迅速侵入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，试验组分别设三个平行皿。

阴性对照组加入0.1mL浸提介质，活化组再加10%S9混合液0.5mL，无活化组加0.2 mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL。阳性对照组分别加入诱变剂（敌克松、叠氮钠、2-氨基芴和1,8-二羟基蒽醌）0.1mL，活化组再加10%S9混合液0.5mL，无活化组加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL。阴性及阳性对照组分别设三个平行皿。全部平皿置37°C倒置培养48～72h观察结果，计算回变菌落数。

1.9 皮下植入试验

供试品裁剪成约1.5 cm×1.5cm小块。

试验采用SPF级SD大鼠15只，每植入周期5只，雌雄不限。使用20g/L戊巴比妥钠，腹腔注射2.3mL/kg麻醉动物，麻醉后对动物背部进行剃毛，并用75%乙醇和2%碘酒消毒。使用钝器解剖法在大鼠背部做皮肤切口，切口部位制备2个皮下囊，囊的底部距皮肤切口10mm以上，分别植入2个样品，植入物之间不可互相接触，手术后涂抹碘酒消毒。分别于观察1周、4周、12周后无痛处死动物，对植入部位周围组织进行肉眼观察，切取包括植入物及其周围足够多未受影响的组织制作病理切片，并进行组织学评价。

2.结果

2.1 细胞毒性试验

供试品组至多20%～50%的细胞呈圆形，疏松贴壁，无胞浆内颗粒，偶见细胞溶解。细胞毒性计分为1分，按标准判定，供试品有轻微细胞毒性。

2.2 迟发型超敏反应试验

斑贴移去后24h及48h，供试品组与阴性对照组动物的激发部位均未见红斑及水肿，反应评级为0级，按标准判定，供试品无致敏性。

2.3 皮内反应试验

按规定的评分标准，72h评分后计算出浸提液和浸提介质的综合平均记分，最后计算出浸提液与浸提介质的综合平均记分之差为0，按标准判定，供试品未引起皮内反应。

2.4 急性全身毒性试验

试验期间，小鼠无毒性症状，无死亡，供试品组体重变化与阴性对照组相比无显著性差异（P＞0.05），按标准判定，供试品未引起急性全身毒性反应。具体结果见表2。

2.5 溶血试验

供试品组溶血率小于5%，按标准判定，供试品未引起溶血反应。具体结果见表3。

2.6 Ames试验

供试品对TA97、TA98、TA100和TA102回变菌落数，在加与不加S9的条件下，均不超过其自发回变数1倍以上，按标准判定，供试品Ames试验为阴性。具体结果见表4。

表2. 急性全身毒性试验动物体重统计（g）

表3. 溶血试验结果

表4. 细菌回复突变结果

2.7 皮下植入试验

显微镜下观察可见：供试品于皮下植入1周后（见图2），样品呈条带状，结构致密；周围有纤维囊形成，厚度中等；植入物周围可见淋巴细胞（＜25个/HPF），较多浆细胞（26～50个/HPF），极少量巨噬细胞（1～5个/HPF），偶见多核巨细胞浸润（1～2个/HPF），增生纤维组织间可见大量毛细血管增生（8～20个/HPF）。植入后4周（见图3），样品呈条带状，结构较松散；纤维囊厚度中等；植入物周围可见淋巴细胞浸润（＜25个/HPF），少量巨噬细胞浸润（5～10个/HPF），极少量多核巨细胞浸润（3～5个/HPF），增生的纤维组织间偶见毛细血管增生（1～3个/HPF）。植入后12周（见图4），样品呈条带状，结构较松散；纤维囊较薄；植入物周围炎症细胞较1周和4周明显减少，仅见少量巨噬细胞浸润（5～10个/HPF），偶见多核巨细胞浸润（1～2个/HPF），增生的纤维组织间偶见毛细血管增生（1～3个/HPF）。

图2. 皮下植入后1周?HE染色（20倍物镜）

图3. 皮下植入后4周?HE染色（20倍物镜）

图4. 皮下植入后12周?HE染色（20倍物镜）

3.讨论

理想的防粘连材料应具有良好的生物相容性、自动粘附性、可降解吸收性，以及足够的体内存留时间，促进伤口愈合并将纤维组织增生降至最低程度等特性[4]。本研究中的防粘连膜以琼脂糖和胶原为主要材料制成，体外细胞毒性试验结果显示其有轻微细胞毒性，从已有研究可知，多糖成分具有选择性抑制纤维细胞增生的作用，这也是琼脂糖胶原防粘连膜具有防粘连作用的机理所在[5]，其细胞毒性计分不大于1分，符合临床使用要求。迟发型超敏反应结果显示其无致敏性，致敏试验能检测受试物存在的残余单体或低分子物质等半抗原是否会与皮肤的蛋白质结合形成完全抗原而引起皮肤过敏，从试验结果可知，琼脂糖胶原防粘连膜不存在致生物体过敏的低分子物质。皮内刺激试验结果显示，家兔背部在注射供试品浸提液后即刻及24h、48h、72h后均未见红斑及水肿情况，记分为0，与阴性对照组结果一致，表明其未引起皮内刺激反应。一般而言，静脉注射是材料与机体接触的最直接快速的方式，急性全身毒性试验中供试品浸提液直接进入血液循环，若有毒性物质，动物可立即表现出各种毒性症状，结果可见其未引起急性全身毒性反应。溶血试验是细胞毒性试验的一个补充性的，而且较灵敏的试验，通过将琼脂糖防粘连膜直接与稀释兔血接触一定时间，其溶血率为1.5%(+)，符合标准要求。

Ames试验是利用鼠伤寒沙门氏菌，在加入哺乳动物肝微粒体酶活化条件下，测定物质诱导回复突变的能力。本研究Aems试验中，供试品各剂量组对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102的回变菌落数与自发回变数相近，表明琼脂糖胶原防粘连膜对鼠伤寒沙门氏菌无致突变作用。皮下植入试验中，材料于1周和4周植入周期结束后，镜下观察病理切片可见植入局部周围有淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润。12周植入周期结束后，炎症反应明显减轻；镜下观察可见，随着植入时间的延长，材料从致密变为疏松，这符合琼脂糖的可降解性。有研究指出，由于动物体内缺乏降解琼脂糖的酶，其体内降解主要依靠巨噬细胞的吞噬作用[6]。Varoni等[7]进行的试验也表明琼脂糖的降解是一个相对缓慢的过程，这于其致密的网络结构和降解机制有关。综上所述，琼脂糖胶原防粘连膜具有良好的生物相容性及可降解性，在术后防粘连方面具有广阔的发展和应用前景。但琼脂糖在体内的降解产物及代谢途径，其与细胞之间的相互作用机理等问题丞待进一步深入研究，以为其临床上的安全使用提供更完善的实验依据。

参考文献

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The Biocompatibility Evaluation of Agarose Collagen Anti-adhesive Film

XIANG Jian TIAN Sheng-hui KE Jun Guangdong Medical Devices Quality Surveillance and Test Institute (Guangzhou 510080)

Absract: Objective: To explore the biocompatibility of agarose collagen anti-adhesive film to provide experimental bases for clinical applications. Methods: According to the standard GB/T16886-ISO10993, to evaluate the biocompatibility of agarose collagen anti-adhesive film using the cytotoxicity test, guinea pig maximization test, animal Intracutaneous (intradermal) reactivity test, acute systemic toxicity test, haemolysis test, Ames test and subcutaneous implant test . Results: There was mild cytotoxicity, no sensitization, no intradermal reactivity, no acute systemic toxic reactivity, no hemolysis and no mutagenicity in Ames test. And, the result of subcutaneous implant test showed that the samples had local tissue irritation on 1 and 4 weeks after implantation, and mild irritation on 12 weeks. Conclusions: These results suggest that agarose collagen anti-adhesive film has favourable biocompatibility and meets the requirements for clinical applications.

agarose collagen anti-adhesive film, biocompatibility, toxicity test

1006-6586(2016)06-0048-06

R318.08

A

2016-01-22

向健，助理工程师

广东省医疗产品生物安全评价科技服务平台（2012B011000003）