HPLC-ELSD法测定琥乙红霉素片中琥乙红霉素的含量

李志得，张彩云，汪 霞（鄂州市食品药品检验检测中心，湖北鄂州 436099）

HPLC-ELSD法测定琥乙红霉素片中琥乙红霉素的含量

李志得＊，张彩云，汪 霞（鄂州市食品药品检验检测中心，湖北鄂州 436099）

目的：建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定琥乙红霉素片中琥乙红霉素含量的方法。方法：色谱柱为Dikma-C18，流动相为乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V），流速为1.0 ml/min，柱温为30℃，进样量为10 μl。结果：琥乙红霉素检测进样量线性范围为1.216～7.296 μg（r＝0.999 2）；定量限为0.304 μg，检测限为0.076 μg；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率为97.59%～104.19%（RSD＝1.71%，n＝6）。结论：该方法操作简便、结果准确、灵敏度高、重复性好，可用于测定琥乙红霉素片中琥乙红霉素的含量。

琥乙红霉素片；高效液相色谱法；琥乙红霉素；含量测定

琥乙红霉素属大环内酯类抗菌药物，为红霉素的琥珀酸乙酯，具有广谱抗菌作用。2015年版《中国药典》（二部）采用水解琥乙红霉素后，用微生物检定法测定其含量[1]，此试验过程复杂、操作烦琐、影响因素多、重复性较差[2]。目前，现有文献多采用高效液相色谱法（HPLC）测定琥乙红霉素的含量[3-6]，均采用紫外检测器，检测波长为210 nm左右；而琥乙红霉素仅在紫外末端有吸收，因此此试验灵敏度低。为尽量减小紫外末端吸收引起的基线干扰，笔者采用HPLC-蒸发光散射检测器（ELSD）法，建立了测定琥乙红霉素片中琥乙红霉素含量的方法，以期为控制该制剂的质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695型HPLC仪，包括2424蒸发光散射检测器、e2695泵、Empower 2色谱工作站（美国Waters公司）；KQ-3000型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：300 W，频率：40 kHz）；BS21S型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药品与试剂

琥乙红霉素片（西安利君制药有限责任公司，批号：1402052、1311474、1403016，规格：0.125 g/片）；琥乙红霉素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130425-200002，纯度＞98%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；进样量：10 μl。.

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取琥乙红霉素对照品0.030 40 g，置于25 ml量瓶中，加乙腈溶解并定容，制成每1 ml含琥乙红霉素1.216 mg的溶液，作为对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液4.0 ml，置于10 ml量瓶中，加乙腈溶解并定容，制成每1 ml含琥乙红霉素0.486 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品10片，精密称定，研细，混匀，精密称取适量（约相当于琥乙红霉素35 mg），置于100 ml量瓶中，加乙腈溶解，超声处理10 min，放冷，加乙腈定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的处方工艺和配方比例，取不含琥乙红霉素的辅料制备阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，琥乙红霉素与其他杂质峰均能达到基线分离，分离度＞2.0；理论板数以琥乙红霉素峰计＞5 000，保留时间为10 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.琥乙红霉素Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.erythromycin ethylsuccinate

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加乙腈定容，摇匀，即得系列对照品溶液。分别精密量取上述系列对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以琥乙红霉素进样量的对数值为横坐标（x）、峰面积的对数值为纵坐标（y）进行线性回归，得琥乙红霉素对数值的回归方程为y＝1.100 5x+6.606 1（r＝0.999 2）。结果表明，琥乙红霉素峰面积的对数值与进样量的对数值线性关系良好，琥乙红霉素检测进样量线性范围为1.216～7.296 μg。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限；当信噪比为3∶1时，得检测限。结果，琥乙红霉素的定量限为0.304 μg，检测限为0.076 μg。

2.6 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，琥乙红霉素峰面积的RSD＝0.92%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密量取同一供试品溶液（批号：1402052）适量，分别于室温下放置0、4、8、12、18、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，琥乙红霉素峰面积的RSD＝1.08%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取同一批样品（批号：1402052）适量，精密称定，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，琥乙红霉素的平均含量为98.4%，RSD＝0.84%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：1402052）6份，研细，精密称取适量（约相当于琥乙红霉素9 mg），分别精密加入琥乙红霉素对照品9 mg，置于50 ml量瓶中，加乙腈适量，超声处理10 min，放冷，加乙腈定容，摇匀，滤过，取续滤液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 样品含量测定

取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按两点外标法计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3，%）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 讨论

3.1 检测方法的选择

目前，琥乙红霉素的测定方法主要有生物检定法[1]、HPLC法[3-6]，紫外分光光度法[7-10]、电化学法[11-12]等。亦有用HPLC法测定琥乙红霉素中游离红霉素[13]、HPLC-串联质谱法测定琥乙红霉素颗粒体内活性代谢物的报道[14]，但上述方法灵敏度低。因此，笔者采用ELSD，可提高检测的灵敏度。

3.2 溶剂和流动相的选择

试验中曾用流动相作为溶剂溶解对照品和样品，但稳定性较差。笔者参考相关文献[4]经过多次试验比较，发现采用乙腈作为溶剂溶解样品，在24 h内具有良好的稳定性。故本试验选择乙腈作为溶剂。关于流动相的选择，笔者曾用乙腈-水、乙腈-乙酸铵缓冲液等作为流动相，结果色谱不出峰或峰形极差，改用乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）后，色谱峰形理想，保留时间合适，理论板数按琥乙红霉素峰计达到5 000以上。因此，本试验最终选择乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）作为流动相。

综上所述，本方法操作简便、结果准确、灵敏度高、重复性好，可用于测定琥乙红霉素片中琥乙红霉素的含量。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：1 246.

[2] 李夏林，张丽英.管碟法测定琥乙红霉素含量的不确定度分析[J].中国医药导报，2011，8（12）：42.

[3] 宋金春，于龙环.HPLC法测定琥乙红霉素静脉乳剂的含量[J].中国药师，2013，16（5）：675.

[4] 陈燕，刘虹，赵海鹏.高效液相色谱法测定琥乙红霉素片的含量[J].中国药品标准，2015，16（2）：130.

[5] 刘雅琴，赵晓頔，王伟娜，等.琥乙红霉素片含量测定方法的改进[J].中国药师，2012，15（4）：510.

[6] 简永耀，靳龙文.HPLC法测定琥乙红霉素片的含量[J].安徽医药，2008，12（8）：692.

[7] 王红专，林冰，袁竹青，等.电荷转移分光光度法测定琥乙红霉素[J].河南化工，2015（6）：52.

[8] 王晓玲，张萍，陈燕.甲基红褪色光度法测定琥乙红霉素[J].应用化工，2014，43（9）：1 712.

[9] 胡小明，彭勤龙.琥乙红霉素与甲基红的荷移反应研究[J].分析科学学报，2015，31（5）：701.

[10] 陈莲惠，谢梦，叶莉，等.甲基绿褪色光度法测定琥乙红霉素[J].分析试验室，2014（2）：187.

[11] 任艳艳，金根娣，胡效亚.琥乙红霉素在碳糊电极上的电化学测定方法[J].应用化学，2011，28（6）：704.

[12] 王伟峰，潘玉莹，杨梅霞，等.毛细管电泳-化学修饰电极电致化学发光法测定琥乙红霉素[J].药物分析杂志，2010，30（10）：1 900.

[13] 罗慧萍，易秋艳，王灿，等.HPLC法测定琥乙红霉素中游离红霉素的含量[J].药物分析杂志，2014，34（12）：2 264.

[14] 王爱华，刘天扬，杨杨，等.HPLC-MS/MS法测定琥乙红霉素颗粒体内活性代谢物[J].药物分析杂志，2011，31（3）：448.

（编辑：刘 柳）

Content Determination of Erythromycin Ethylsuccinate in Erythromycin Ethylsuccinate Tablet by HPLCELSD

LI Zhide，ZHANG Caiyun，WANG Xia（Ezhou Center for Food and Drug Control，Hubei Ezhou 436099，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of erythromycin ethylsuccinate in Erythromycin ethylsuccinate tablet.METHODS：The column of Dikma-C18with mobile phase of acetonitrile-0.05%diethylamine（70∶30，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，column temperature was 30℃，and the sample size was 10 μl.RESULTS：The linear range of erythromycin ethylsuccinate was 1.216-7.296 μg（r＝0.999 2）；limit of quantitation was 0.304 μg，the limits of detection was 0.076 μg，respectively；the RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no more than 2.0%，the average recoveries was 97.59%-104.19%（RSD＝1.71%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate with high sensitivity and reproducibility，and can be used for the content determination of Erythromycin ethylsuccinate tablet.

Erythromycin ethylsuccinate tablet；HPLC；Erythromylin ethyisuccinate；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4744-03

2015-11-30

2016-05-16）

＊副主任技师。研究方向：抗菌药物及中药检验。电话：0711-3863027。E-mail：Lzd-5@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.46