HPLC法测定妥舒沙星环合物中的有关物质

章 激（湖北文理学院附属医院，湖北襄阳 441021）

HPLC法测定妥舒沙星环合物中的有关物质

章 激＊（湖北文理学院附属医院，湖北襄阳 441021）

目的：建立测定妥舒沙星环合物中有关物质的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为YMC-Pack ODS A-312，流动相为乙腈-水（5∶3，V/V），流速为1.2 ml/min，检测波长为250 nm，柱温为25℃，进样量为10µl。结果：该色谱条件能将妥舒沙星环合物中主成分与有关物质基线分离；妥舒沙星环合物检测质量浓度线性范围为0.04～1.8 μg/ml（r＝0.999 9）；妥舒沙星环合物定量限为40.56 ng/ml，检测限为6.3 ng/ml；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜3%；回收率为99.88%～100.68%（RSD＝0.29%，n＝9）；6批样品总杂质含量测定结果均＜0.1%。结论：该方法专属性强，灵敏度、准确度和精密度高，可用于妥舒沙星环合物中有关物质的测定。

妥舒沙星环合物；高效液相色谱法；有关物质

妥舒沙星（Tosufloxacin）是日本富山化学工业公司于1990年开发上市的第三代广谱氟喹诺酮类抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌的抗菌活性明显强于环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等同类药物[1]。目前，妥舒沙星片剂已在国内上市并广泛应用于临床治疗中。国内文献[2-6]相继报道了甲苯磺酸妥舒沙星分散片、包合物、凝胶、滴眼液、滴耳液的制备及质量控制方法。

妥舒沙星环合物为妥舒沙星合成过程中的重要中间体，其质量控制情况将直接影响原料药的生产合格率，因此建立其中有关物质的测定方法显得尤为重要。国内一些文献[7-10]曾报道了妥舒沙星制剂含量或用药后血液中药物浓度测定的方法，却鲜有关于其中间体妥舒沙星环合物中有关物质测定的报道。因此，本试验采用高效液相色谱法（HPLC），初步建立了测定妥舒沙星环合物中有关物质的方法，为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A型HPLC仪，包括SPD-20A可变波长紫外检测器、LCsolution色谱工作站等（日本岛津公司）；Secura225D-1CN型电子天平（德国赛多利斯公司）；DHG-9240A型数显真空干燥箱（上海和呈仪器制造有限公司）；YP-250SDP型综合药品稳定性试验箱（上海林频仪器股份有限公司）。

1.2 药品与试剂

妥舒沙星环合物样品（批号：S-140702、140601、140602、140603、140604、140605、140606）、妥舒沙星环合物对照品（批号：R-140701，纯度：97.1%）均为湖北某研究所药物化学研究室提供，使用前干燥至恒质量；乙腈（色谱纯，美国Honey Well公司）；试验用水为高纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YMC-Pack ODS A-312（150 mm×6.0 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（5∶3，V/V）；流速：1.2 ml/min；检测波长：250 nm；柱温：25℃；进样量：10µl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白溶液 以流动相为空白溶液。

2.2.2 对照品溶液 精密称取妥舒沙星环合物对照品约50 mg，置于50 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密称取样品约50 mg，置于50 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.4 对照溶液 精密量取“2.2.3”项下供试品溶液1 ml，用流动相定容于100 ml量瓶中，摇匀，作为对照溶液。

2.3 系统适用性与专属性试验

2.3.1 系统适用性试验 取“2.2”项下空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各适量，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。在该色谱条件下，妥舒沙星环合物与有关物质能基线分离，主成分峰与相邻成分峰的分离度＞1.5，理论板数以主成分峰计＞3 500。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图A.空白；B.对照品；C.供试品；1.妥舒沙星环合物Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.blank；B.reference substance；C.test sample；1.tosufloxacin cyclizaton

2.3.2 专属性试验 精密称取样品（批号：S-140702）约50 mg，共3份，分别置于50 ml量瓶中，其中一份加入1 mol/L盐酸溶液1 ml，室温放置1 h后加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml中和；一份加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml，室温放置1 h后加入1 mol/L盐酸溶液1 ml中和；一份加入30%过氧化氢溶液1 ml，室温放置1 h。以上3份经处理后的样品分别用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，待用。另取样品适量，共2份，分别置于扁型称量瓶中，一份于60℃的恒温箱中放置15 d；一份于光照强度（4 500±500）lx的稳定性试验箱内放置15 d。精密称取上述2份经处理后的样品各50 mg，分别置于50 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，待用。分别取上述5份破坏试验溶液各适量，以0.45 μm微孔滤膜滤过后，分别取续滤液10µl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图2。结果，样品经酸、碱、氧化、高温、光照破坏试验后，主成分峰均能与降解峰、杂质峰有效分离，分离度＞1.5。

图2 专属性试验高效液相色谱图A.酸破坏样品；B.碱破坏样品；C.氧化破坏样品；D.高温破坏样品；E.光破坏样品；1.妥舒沙星环合物Fig 2 HPLC chromatograms of specificity testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by heat；E.sample destroyed by light；1.tosufloxacin cyclizaton

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下对照品溶液0.4、1.0 ml，置于100 ml量瓶中，0.3、0.7、1.0、1.5、1.8 ml置于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制得系列线性工作贮备液。分别精密量取上述系列线性工作贮备液各1 ml，置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制得系列线性工作溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以妥舒沙星环合物质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程y＝36.012x+994.56（r＝0.999 9）。结果表明，妥舒沙星环合物检测质量浓度线性范围为0.04～1.8 μg/ml。

2.5 定量限与检测限考察

精密量取“2.2.2”项下对照品溶液适量，分别用流动相进行逐级稀释，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，其测试范围至少为半峰宽的5倍。当信噪比为10∶1时，测得的质量浓度为定量限；当信噪比为3∶1时，测得的质量浓度为检测限。结果，妥舒沙星环合物定量限为40.56 ng/ml，检测限为6.3 ng/ml。

2.6 精密度试验

取“2.2.2”项下对照品溶液适量，分别按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，妥舒沙星环合物峰面积的RSD＝0.67%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.3”项下供试品溶液（批号：S-140702）适量，分别于室温下放置0、4、8、12、16、20、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，总杂质峰面积的RSD≤2.87%（24 h时RSD＝2.87%，n＝7），表明供试品溶液在室温下放置24 h内较稳定。

2.8 重复性试验

精密称取样品（批号：S-140702）约50 mg，共6份，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.4”项下方法制备对照溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以自身对照法测定总杂质的含量。结果，总杂质含量的RSD＝2.56%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 回收率试验

精密称取妥舒沙星环合物对照品约40、50、60 mg，各3份，分别按“2.2.3”项下方法制得80%、100%、120%限度浓度的供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算主成分含量并计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Result of recovery test（n＝9）

2.10 样品中有关物质测定

分别称取6批（除S-140702外）样品约50 mg，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.4”项下方法制备对照溶液。分别取上述供试品溶液和对照溶液各10µl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以自身对照法测定其中总杂质及最大单个杂质的含量，结果见表2。由表2可见，最大单个杂质含量＜0.05%，总杂质含量＜0.1%，符合质控标准要求。

3 讨论

本试验通过对检测波长进行考察，发现采用250 nm为检测波长时，能有效检出供试品溶液中的有关物质，结果准确、可靠，信噪比符合要求。故最终选定了该检测波长。

表2 样品中有关物质测定结果（n＝3）Tab 2 Results of determination of related substances in samples（n＝3）

本试验前期曾比较了不同体积比（2∶1、2∶3、5∶3，V/V）的乙腈-水为流动相时的分离效果。结果发现，乙腈-水体积比为2∶1时，主峰出峰时间过快（约5 min出峰），与杂质峰不能有效分离（分离度＜1.5），专属性不佳；体积比为2∶3时，主峰出峰时间较慢，理论板数较低（＜3 000），不符合药典标准；而当体积比为5∶3时，出峰时间适宜，主峰与杂质峰能有效分离（分离度＞1.5），且理论板数较高（＞3 000）。故最终选定以乙腈-水（5∶3，V/V）为本试验的流动相。

综上所述，本方法专属性强，灵敏度、准确度和精密度高，能有效分离主成分峰与杂质峰及酸、碱、氧化、高温、光照破坏条件下产生的降解峰，可用于妥舒沙星环合物中有关物质的测定。

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（编辑：周 箐）

Determination of Related Substances in Tosufloxacin Cyclizaton by HPLC

ZHANG Ji（Hospital Affiliated to Hubei College of Arts and Sciences，Hubei Xiangyang 441021，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of related substances in tosufloxacin cyclizaton.METHODS：HPLC was performed on the column of YMC-Pack ODS A-312 with mobile phase of acetonitrile-water（5∶3，V/V）at a flow rate 1.2 ml/min，detection wavelength was 250 nm，column temperature was 25℃ and injection volume was 10µl.RESULTS：The main component and related substances could be baseline separated by the conditions；the linear range was 0.04-1.8 μg/ml（r＝0.999 9）；the limit of quantification was 40.56 ng/ml and the limit of detection was 6.3 ng/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recovery was 99.88%-100.68%（RSD＝0.29%，n＝9）；the result of total impurities of 6 batches of sample were less than 0.1%.CONCLUSIONS：The method is specific，sensitivity with high accuracy and precision，and can be used for the determination of related substances in tosufloxacin cyclizaton.

Tosufloxacin cyclizaton；HPLC；Related substance

R927

A

1001-0408（2016）33-4730-03

2016-07-06

2016-09-27）

＊副主任药师。研究方向：医院药学及临床药学。E-mail：xfhost@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.41