HPLC法同时测定复方三嗪芦丁片中5种成分的含量

范桂强，宋更申，杜艳雪，张李莉（.衡水市食品药品检验检测中心，河北 衡水 05000；.河北省药品检验研究院，石家庄 0500；.衡水市哈励逊国际和平医院，河北衡水 05000）

HPLC法同时测定复方三嗪芦丁片中5种成分的含量

范桂强1＊，宋更申2，杜艳雪3，张李莉1（1.衡水市食品药品检验检测中心，河北 衡水 053000；2.河北省药品检验研究院，石家庄 050011；3.衡水市哈励逊国际和平医院，河北衡水 053000）

目的：建立同时测定复方三嗪芦丁片中维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪、利血平含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为ZORBAX SB-C18，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.5 ml/min，检测波长为291 nm（0～3 min，维生素B6）、273 nm（3～5 min，氢氯噻嗪）、251 nm（5～11 min，芦丁和盐酸异丙嗪）、218 nm（11 min，利血平），柱温为30℃，进样量为20 μl。结果：维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪和利血平检测质量浓度线性范围分别为84.0～1 344.0 μg/ml（r＝0.999 8）、171.0～2 736.0 μg/ml（r＝0.999 2）、428.0～6 848.0 μg/ml（r＝0.999 9）、173.5～2 776.0 μg/ml（r＝0.999 5）、5.03～80.48 μg/ml（r＝0.999 1）；定量限分别为18.80、14.92、25.70、12.20、4.99 ng，检测限分别为5.54、4.50、8.04、3.66、1.50 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜1.0%；加样回收率分别为98.20%～100.60%（RSD＝0.89%，n＝6）、99.11%～100.28%（RSD＝0.39%，n＝6）、99.07%～100.12%（RSD＝0.38%，n＝6）、98.27%～99.70%（RSD＝0.50%，n＝6）、97.41%～99.40%（RSD＝0.88%，n＝6）。结论：该方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于同时测定复方三嗪芦丁片中维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪、利血平的含量。

高效液相色谱法；复方三嗪芦丁片；维生素B6；氢氯噻嗪；芦丁；盐酸异丙嗪；利血平；含量测定

复方三嗪芦丁片收载于《国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准》[1]第十四册，标准号为WS-10001-（HD-1363）-2003，是由氢氯噻嗪、硫酸双肼屈嗪、盐酸异丙嗪、芦丁、磷酸氯喹、维生素B6、利血平等7种主要成分及辅料制成的复方制剂，主要用于治疗早、中期的高血压病，因价格低廉、疗效确切，为基层临床常用抗高血压药物。氢氯噻嗪为利尿降压药；盐酸异丙嗪为抗组胺药，能竞争性阻滞组胺H1受体，可对抗组胺所导致的毛细血管扩张，降低通透性；维生素B6可保护血管内皮细胞；利血平通过阻滞肾上腺素能神经元而起到降压作用；芦丁能保持血管弹性，减少血管脆性，降低毛细血管通透性[2]。由于该制剂成分复杂，原标准中仅对氢氯噻嗪和盐酸异丙嗪进行含量测定；现有相关文献也仅对该制剂中利血平[3-4]、硫酸双肼屈嗪[5]的含量进行测定。为更好地控制该制剂的质量，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）建立了同时测定复方三嗪芦丁片中维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁[6-7]、盐酸异丙嗪和利血平含量的方法。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括G1315B二极管阵列检测器、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、Chemstation B0302色谱工作站（美国Agilent公司）；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：400 W，频率：40 kHz）；XS205DU型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

复方三嗪芦丁片（沈阳某制药有限公司，批号：20150101、20150216、20150426，规格：每片含氢氯噻嗪2.0 mg、盐酸异丙嗪2.0 mg、维生素B61.0 mg、芦丁5.0 mg、利血平0.03 mg）；氢氯噻嗪对照品（批号：100309-201404，纯度：99.7%）、盐酸异丙嗪对照品（批号：100422-201002，纯度：99.4%）、芦丁对照品（批号：100080-201408，纯度：90.2%）、维生素B6对照品（批号：100116-201103，纯度：100.0%）、利血平对照品（批号：100041-201012，纯度：99.4%，60℃减压干燥3 h后备用）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[8-9]

色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.5 ml/min；检测波长：291 nm（0～3 min，维生素B6）、273 nm（3～5 min，氢氯噻嗪）、251 nm（5～11 min，芦丁和盐酸异丙嗪）、218 nm（11 min，利血平）；柱温：30℃；进样量：20 μl。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取利血平对照品10.12 mg，置于200 ml棕色量瓶中；再精密称取维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪对照品各84.00、171.51、475.50、174.54 mg，分别置于50 ml棕色量瓶中，加甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）定容，摇匀，制得利血平、维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁和盐酸异丙嗪质量浓度分别为50.30、1.68、3.42、8.56、3.47 mg/ml的单一对照品贮备液。取上述单一对照品贮备液各2 ml，置于同一10 ml棕色量瓶中，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于氢氯噻嗪14 mg），置于20 ml棕色量瓶中，加甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）定容于15 ml，超声处理4 min，冷却至室温，加甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 空白对照溶液 按样品的处方比例，称取空白辅料适量，按“2.2.2”项下方法制备空白对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以盐酸异丙嗪峰计为6 000，保留时间为10.18 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8 ml，分别置于20 ml量瓶中，加甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）定容，摇匀，即得系列线性溶液。取上述系列线性溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.空白对照；1.维生素B6；2.氢氯噻嗪；3.芦丁；4.盐酸异丙嗪；5.利血平Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.blank control；1.vitamin B6；2.hydrochlorothiazide；3.rutin；4.promethazine hydrochloride；5. reserpine

表2 回归方程与线性范围Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD），结果见表3。

表3 定量限与检测限测定结果Tab 3 Determination results of detection limit and quantitation limit

2.6 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪、利血平峰面积的RSD分别为0.14%、0.26%、0.42%、0.38%、0.54%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密量取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20150101）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪和利血平峰面积的RSD分别为0.36%、0.52%、0.44%、0.30%、0.69%（n＝7），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取样品（批号：20150101）细粉约0.26 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪和利血平的平均含量分别为99.8%、98.2%、98.9%、100.4%、97.8%，RSD分别为0.72%、0.48%、0.80%、0.63%、0.92%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：20150101）细粉适量（约为2片），分别加入一定质量的维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪和利血平对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表4。

表4 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 4 Results of recovery test（n＝6）

2.10 样品含量测定

取3批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量，结果见表5。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

由于复方三嗪芦丁片中各成分的溶解性差异较大，氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪和利血平为脂溶性药物，在甲醇中易溶解；维生素B6为水溶性药物，在水溶液中易溶解，且其在酸性溶液中稳定性较好。笔者经试验选择甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）为溶剂时，上述5种成分均能很好溶解。因此，本试验选择甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）为溶剂。

表5 样品含量测定结果（n＝3，mg/片）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/tablet）

3.2 检测波长的选择

取“2.2.1”项下维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪和利血平的单一对照品贮备液各适量，采用二极管阵列检测器进行全波长扫描。结果，维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪和利血平分别在291、273、251、251、218 nm波长处有最大吸收。为提高检测灵敏度，笔者根据各成分的出峰时间，运用波长切换技术[9-10]，均采用最大吸收波长进行测定。因此，本试验的检测波长分别为291 nm（0～3 min，维生素B6）、273 nm（3～5 min，氢氯噻嗪）、251 nm（5～11 min，芦丁和盐酸异丙嗪）、218 nm（11 min，利血平）。

3.3 流动相的选择

笔者考察了乙腈-水[3]、甲醇-水[4]、0.01 mol/L己烷磺酸钠-乙腈-甲醇-冰乙酸（用三乙胺调节pH至3.0）[10]、0.2%己烷磺酸钠（用冰乙酸调节pH至3.5）-甲醇-乙腈[11]、0.01 mol/L庚烷磺酸钠-乙腈-三乙胺[12]、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液等作为流动相时对维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪和利血平各成分峰的影响。结果，当乙腈-水、甲醇-水、0.01 mol/L己烷磺酸钠-乙腈-甲醇-冰乙酸（用三乙胺调节pH至3.0）、0.2%己烷磺酸钠（用冰乙酸调节pH至3.5）-甲醇-乙腈、0.01 mol/L庚烷磺酸钠-乙腈-三乙胺、甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相时，各成分色谱峰出现了峰形开叉、难以分离、其他成分干扰及个别成分不能检出的情况；当以乙腈-0.2%磷酸溶液作为流动相时，各成分峰形和分离良好。因此，本试验选择乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱。

综上所述，本方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于同时测定复方三嗪芦丁片中维生素B6、氢氯噻嗪、芦丁、盐酸异丙嗪、利血平的含量。

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（编辑：刘 柳）

Simultaneous Determination of Five Components in the Compound Trizin and Rutinum Tablet by HPLC

FAN Guiqiang1，SONG Gengshen2，DU Yanxue3，ZHANG Lili1（1.Hengshui Centre for Food and Drug Control，Hebei Hengshui053000，China；2.Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，China；3.Hengshui Halison International Peace Hospital，Hebei Hengshui 053000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of vitamin B6，hydrochlorothiazide，rutin，promethazine hydrochloride and reserpine in Compound trizin and tutinum tablet.METHODS：HPLC was performed on the column of Agilent Zorbax SB-C18with mobile phase of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.5 ml/min，detection wavelength was 291 nm（0-3 min，vitamin B6），273 nm（3-5 min，hydrochlorothiazide），251 nm（5-11 min，rutin，promethazine hydrochloride）and 218 nm（11 min，reserpine），column temperature was 30℃，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 84.0-1 344.0 μg/ml for vitamin B6（r＝0.999 8），171.0-2 736.0 μg/ml for hydrochlorothiazide（r＝0.999 2），428.0-6 848.0 μg/ml for rutin（r＝0.999 9），173.5-2 776.0 μg/ml for promethazine hydrochloride（r＝0.999 5）and 5.03-80.48 μg/ml for reserpine（r＝0.999 1）；limits of quantification were 18.80，14.92，25.70，12.20，4.99 ng，limits of detection were 5.54，4.50，8.04，3.66 1.50 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 1.0%；recoveries were 98.20%-100.60%（RSD＝0.89%，n＝6），99.11%-100.28%（RSD＝0.39%，n＝6），99.07%-100.12%（RSD＝0.38%，n＝6），98.27%-99.70%（RSD＝0.50%，n＝6），97.41%-99.40%（RSD＝0.88%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate with high sensitivity and good reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of vitamin B6，hydrochlorothiazide，rutin，promethazine hydrochloride and reserpine in Compound trizin and tutinum tablet.

HPLC；Compound trizin and tutinum tablet；Vitamin B6；Hydrochlorothiazide；Rutin；Promethazine hydrochloride；Reserpine；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4722-04

2016-01-07

2016-09-01）

＊副主任药师。研究方向：食品、药品检验分析。电话：0318-2369176。E-mail：Sagefan@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.38