大鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养及CM-DiI标记后的传代示踪

周 虹，郭 杏，李 丹，高小春，熊爱兵，谭美云



大鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养及CM-DiI标记后的传代示踪

周 虹1，郭 杏1，李 丹1，高小春1，熊爱兵1，谭美云2

目的 建立大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外分离培养和细胞标记的方法，探讨CM-DiI标记ADSCs在体外传代示踪的可行性。方法 无菌切取SD大鼠腹股沟脂肪组织，运用酶原消化并差速贴壁的方法获取原代细胞并进行传代培养。观察细胞形态，对第3代ADSCs进行细胞表型鉴定和成骨成脂分化能力鉴定。采用CM-DiI标记第3代ADSCs并进行传代培养，荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察荧光标记情况，流式细胞仪检测标记率。结果 ADSCs呈长梭形、漩涡样生长，传代后细胞生长增殖速度加快。流式细胞仪检测结果显示CD29、CD90阳性表达，CD34、CD45、CD31阴性表达。茜素红和油红O染色显示ADSCs具有成骨成脂分化潜能。CM-DiI标记的红色荧光存在于细胞膜和细胞质，不存在于细胞核，传代培养后荧光有所衰减，第3、6、9代的荧光标记率分别为97.09%、66.21%和37.86%。结论 大鼠ADSCs的生长增殖能力强，具有多向分化潜能，采用CM-DiI标记ADSCs简单易行且示踪效果良好，可为后期体内实验提供依据。

脂肪间充质干细胞；细胞培养；CM-DiI；细胞标记

脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)在2001年首先由Zuk et al[1]从人脂肪组织中发现，其类似于骨髓间充质干细胞，能够稳定增殖及自我更新，具有多向分化潜能。与其他干细胞相比，ADSCs具有来源广泛、取材容易且获取率高、体外扩增快、细胞老化率低、免疫原性低等优点[2]，其本身也具有血管原性和抗炎活性，能促进组织新生血管形成[3]，这些优点使得ADSCs成为优势细胞而备受关注。CM-DiI是一种亲脂性荧光染料，不溶于水，容易嵌进生物质膜内并作定向扩散运动标记整个胞膜，也能通过活体细胞胞饮作用进入胞质从而标记整个胞质[4]，并且其无细胞毒性，不影响细胞生长和增殖，标记时间长，易于操作，适合标记和示踪细胞[5]。该研究以CM-DiI标记ADSCs并传代示踪，用流式细胞仪检测传代后的荧光标记率，为后期进行体内实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 DMEM/F12培养基、胰蛋白酶(美国HyClone 公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)；成脂成骨诱导液(广州赛业公司)；CD29、CD90、CD34、CD45、CD31抗体及大鼠相应的同型对照抗体、流式细胞仪(美国BD公司)；CM-DiI(美国 Molecular Probe 公司，编号c7000)；生物安全柜(西班牙Telstar公司，Telstar Bio ⅡA)；CO2培养箱(美国Thermo 公司)；倒置相差显微镜、倒置荧光显微镜(日本Olympus 公司)；激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)。

1.2 实验动物 6周龄雄性SPF 级 SD 大鼠 2只，150～180 g，由西南医科大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.3 实验方法

1.3.1 ADSCs分离、培养、传代 用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后将其脱颈处死，在75%酒精中浸泡消毒10 min，无菌切取两侧腹股沟处皮下脂肪组织，放于PBS中反复冲洗3次，尽可能完全剔除血管和筋膜，再用眼科剪将其剪碎至糊状，装入无菌的50 ml离心管中，加入2～3倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，置于37 ℃恒温水浴中震荡消化60 min(期间反复震荡混匀至少3次)，直至脂肪组织呈乳糜状，加入等量完全培养基终止消化，70 μm滤网过滤后再加入完全培养基1 500 r/min离心10 min,弃上清液和上层脂肪液，加入PBS吹打混匀后1 000 r/min离心5 min,弃上清液，最后加入完全培养基重悬吹打混匀，以5×105/ml细胞数接种，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后，全量换液。根据细胞生长情况，2～3 d换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。待细胞达80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3.2 流式细胞仪鉴定ADSCs 将第3代细胞用0.25%胰蛋白酶消化后分装入10个EP管中，制备100 μl，细胞密度为1×106/ml的单细胞悬液。前5管为阴性对照，加入等量相应的同型对照抗体。其余5管分别加入CD29-APC、CD90-PE-Cy7、CD34-PE、CD45-PerCP、CD31-PE各1 μl，室温避光孵育15～20 min，400 μl PBS重悬后，上流式细胞仪检测。

1.3.3 ADSCs的成骨成脂分化潜能 以每孔2×105个细胞的密度将第3代ADSCs接种到6孔板中，待细胞融合度达到80%～90%时分别更换成骨和成脂分化诱导培养基进行诱导培养，更换等量的完全培养基作为阴性对照。成骨诱导3周后采用茜素红染色观察细胞的成骨分化效果。成脂分化诱导2周后采用油红O染色观察细胞的成脂分化效果。阴性对照组也进行相应染色。

1.3.4 CM-DiI荧光标记ADSCs 取出一支CM-DiI，室温避光溶解后向管中加入50 μl DMSO混匀，以4 μl CM-DiI与1 ml PBS配成浓度为4 g/L的工作液。将1×106个细胞重悬于1 ml CM-DiI工作液中，先将其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min。1 000 r/min离心5 min,将细胞分为3部分，一部分用于流式细胞仪检测CM-DiI的标记率，另一部分用于荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜照相，最后一部分用于传代培养。

2 结果

2.1 ADSCs的形态学观察 在倒置相差显微镜下观察，刚接种到培养瓶的原代细胞比较杂，有大量呈圆形的细胞和少数脂滴漂浮，见图1A。约4 h时，细胞开始贴壁，24 h换液时见部分细胞呈梭形、三角形，但仍有少量脂滴，见图1B。此后的2～4 d，细胞大部分伸展、体积变大，在4 d再次换液时已可见细胞呈集落或团簇样生长，呈鱼群和旋涡状，见图1C。细胞在7～8 d已有80%～90%融合，随即消化传代。消化传代后的细胞生长增殖速度明显较原代细胞快，细胞逐渐变纯，已无脂滴漂浮，见图1D。到第3代后的细胞越发纯化，约不到1 h时即贴壁，生长增殖迅速，形态均一，呈现明显的鱼群和旋涡状生长，见图1E。连续传至11代时，细胞形态无明显变化，见图1F。

图1 倒置相差显微镜下大鼠ADSCs形态观察

A：刚接种的原代细胞形态 ×40；B：接种24 h时的细胞形态 ×100；C：接种4 d时的细胞形态 ×40；D：第1代细胞形态 ×40；E：第3代细胞形态 ×40；F：第11代细胞形态 ×40

2.2 流式细胞仪鉴定细胞表型 第3代ADSCs的表面标志物 CD29、CD90阳性表达，表达率分别为95.04%、99.65%；而 CD34、CD45、CD31阴性表达，表达率分别为0.17%、0.20%、0.14%。见图2。

2.3 ADSCs的体外诱导成骨成脂分化 成骨诱导3周时，见部分细胞形态较模糊，部分呈椭圆形、多形性，细胞间形成钙质沉积，茜素红染色呈阳性，见图3A；成脂诱导4 d时，可见部分细胞由长梭形变为肥大增宽的多形性细胞，细胞质内开始出现小脂滴，随着诱导时间延长，脂滴开始增多、变大，2周时可见大多数细胞胞质内出现大小不一的脂滴，油红O染色呈阳性,见图3B；对照组染色呈阴性结果，见图3C、3D。

2.4 ADSCs的CM-DiI体外标记结果 第3代ADSCs标记好后荧光显微镜观察，几乎全部细胞标记为红色荧光，见图4A，贴壁后激光扫描共聚焦显微镜观察显示CM-DiI标记细胞膜和细胞质，不标记细胞核，见图4B。传代培养后，荧光有所衰减。传第6代时，红色荧光仍较强，但较前减弱，见图4C；传第9代时荧光强度明显减弱，但未消失，见图4D。

图2 流式细胞仪鉴定大鼠ADSCs

A:CD29-APC;B:CD90-PE-Cy7;C:CD34-PE;D:CD45-PerCP;E:CD31-PE

图3 大鼠ADSCs成骨成脂分化

A：成骨实验组茜素红染色 ×100；B：成脂实验组油红O染色 ×200；C：成骨对照组茜素红染色 ×100；D：成脂对照组油红O染色 ×100

第3、6、9代ADSCs的CM-DiI荧光标记率分别为97.09%、66.21%和37.86%，见图5。

3 讨论

研究[6]显示，ADSCs与骨髓间充质干细胞有着相似的生物学性状、细胞表型和分化潜能，但其有来源丰富、增殖率高、自体移植不产生排异反应等优点而广泛应用于再生医药和组织工程领域中。本实验采用酶原消化并差速贴壁的方法分离培养ADSCs，酶的浓度和消化时间是原代细胞提取成功的关键因素，实验中采用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化60 min，多次预实验证明这是一个比较好的浓度和时间。对于取材部位，近年来先后有文献[7-8]报道取材于背部、颈部、附睾、肠系膜、腹腔的ADSCs。但在之前的预实验中发现附睾、腹腔等处的脂肪组织都较少，难以满足实验对细胞量的需求，所以本实验在取材时选取SD大鼠腹股沟处皮下脂肪组织，此处脂肪组织最为丰富，便于尽可能多的分离ADSCs，只要尽可能剔除其中的血管和筋膜，避免过多的杂细胞混入就能提取出较纯的ADSCs。在消化脂肪组织的过程中未使用任何裂解液来裂解混杂的红细胞，因红细胞有不贴壁的特性，待ADSCs贴壁后便可以通过换液去除，这样也可以避免裂解液对ADSCs的损伤和影响作用[9]。同时通过换液和消化传代可以去除漂浮的脂滴和杂细胞，使细胞得以纯化。在培养过程中，见ADSCs呈长梭形、多角形、鱼群样、漩涡样生长，传代后细胞生长增殖速度快，连续传至11代细胞形态无明显变化，证明其生长增殖能力强。

图4 CM-DiI标记大鼠ADSCs

A：荧光显微镜下CM-DiI标记的第3代悬浮状态的ADSCs ×100；B：激光扫描共聚焦显微镜下CM-DiI标记的贴壁状态的ADSCs×400；C：荧光显微镜下CM-DiI标记的第6代贴壁状态的ADSCs ×100；D：荧光显微镜下CM-DiI标记的第9代贴壁状态的ADSCs ×100

图5 流式细胞仪检测第3、6、9代ADSCs的CM-DiI荧光标记率

已有研究[5,10-11]表明，ADSCs能够表达CD13、CD44、CD29、CD73、CD90、CD59、CD105、CD166、STRO-1等，而不表达CD3、CD4、CD31、CD34、CD45、CD56、CD106等。该研究选取CD29、CD90、CD34、CD45、CD31作为检测的表面标志物，结果显示CD29、CD90阳性表达，表达率分别为95.04%、99.65%；CD34、CD45、CD31阴性表达，表达率分别为0.17%、0.20%、0.14%，可以初步证明本实验分离培养所得细胞为ADSCs，且细胞纯度较高。要进一步证实其为ADSCs还必须对其进行分化诱导检测，该研究对第3代实验组细胞行成骨成脂诱导分化，在诱导3周时对其进行茜素红染色，可见钙结节沉积，在诱导2周时对其行油红O染色，可见细胞质内有大小不一的脂滴形成，而对照组细胞无上述表现，证明所分离培养细胞具有成骨成脂分化潜能，为ADSCs。

近年来，用于细胞标记示踪的方法主要有荧光染料标记法(DiI、DAPI、PKH26、Hoechst33342/33258等)、GFP标记法、核酸标记法(同位素标记、5-BrdU标记等)及Y染色体标记法等[12]，都各有其特点。但是上述方法或多或少有操作繁琐、标记时间短且标记率不高、对细胞有一定毒性等缺点而限制了其应用。而CM-DiI为一种羰花青亲脂性荧光染料，其荧光激发波长为553 nm，发射波长为570 nm，能够与细胞质和细胞膜结合发出强大的红色荧光，并且对细胞无毒性作用，适于标记和示踪细胞[13]。我国也有研究者用CM-DiI标记骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞和兔外周血平滑肌祖细胞[14-15]，均证明CM-DiI标记细胞简单易行、染色速度快、对细胞无毒性，具有良好的应用前景。该研究用CM-DiI标记SD大鼠ADSCs，由于ADSCs为贴壁细胞，标记时可采用以下两种方法：一是将贴壁细胞消化后离心成细胞沉淀，再直接用CM-DiI工作液重悬，先将其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min；二是将贴壁细胞用PBS清洗2～3遍后，直接用CM-DiI工作液标记，保证染液恰好覆盖全层细胞即可，先将其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min。该研究采用第一种方法标记第3代SD大鼠ADSCs，荧光显微镜下观察几乎全部细胞标记为红色荧光，流式细胞仪测标记率为97.09%，传代至第6代时荧光仍较强，标记率为66.21%，传代至第9代时荧光减弱较快，但仍未消失，标记率为37.86%，证明CM-DiI标记后的ADSCs可稳定传代，维持荧光存在。传代后标记率减低、荧光强度逐渐减弱的原因可能是：① 实验过程中细胞换液、传代未能完全避光；② 细胞增殖分裂导致染料相对减少；③ CM-DiI自发出现荧光泯灭；④ 显微镜观察拍照时间过久导致荧光减少。

综上所述，运用酶原消化并差速贴壁的方法可获取纯度高、生长增殖能力强和具有多向分化潜能的ADSCs，CM-DiI标记细胞简单易行，标记率高，具有标记细胞后传代示踪的可行性，可作为标记和示踪SD大鼠脂肪间充质干细胞的良好荧光染料。

[1] Zuk P A, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies[J]. Tissue Eng, 2001,7(2):211-28.

[2] Taha M F, Hedayati V. Isolation, identification and multipotential differentiation of mouse adipose tissue-derived stem cells[J]. Tissue Cell, 2010,42(4):211-6.

[3] Zografou A, Papadopoulos O, Tsigris C, et al. Autologous transplantation of adipose-derived stem cells enhances skin graft survival and wound healing in diabetic rats[J]. Ann Plast Surg, 2013,71(2):225-32.

[4] Wei H, Ooi T H, Tan G, et al. Cell delivery and tracking in post-myocardial infarction cardiac stem cell therapy: an introduction for clinical researchers[J]. Heart Fail Rev, 2010,15(1):1-14.

[5] Dong Y, Hassan W U, Kennedy R, et al. Performance of an in situ formed bioactive hydrogel dressing from a peg-based hyperbranched multifunctional copolymer[J]. Acta Biomater, 2014,10(5):2076-85.

[6] Wilson A, Butler P E, Seifalian A M. Adipose-derived stem cells for clinical applications: A review[J]. Cell Prolif, 2011,44(1):86-98.

[7] Hsu L W, Goto S, Nakano T, et al. The effect of exogenous histone h1 on rat adipose-derived stem cell proliferation, migration, and osteogenic differentiationinvitro[J]. J Cell Physiol, 2012,227(10):3417-25.

[8] 李玲慧, 丁道芳, 龚 浩, 等. 大鼠腹腔脂肪干细胞的分离培养及诱导成骨[J]. 中国组织工程研究, 2013,17(23):4232-9.

[9] Strem B M, Hicok K C, Zhu M, et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J]. Keio J Med, 2005,54(3):132-41.

[10]Hadad I, Johnstone B H, Brabham J G, et al. Development of a porcine delayed wound-healing model and its use in testing a novel cell-based therapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2010,78(3):888-96.

[11]Huang S P, Huang C H, Shyu J F, et al. Promotion of wound healing using adipose-derived stem cells in radiation ulcer of a rat model[J]. J Biomed Sci, 2013,20:51.

[12]Yang H N, Park J S, Na K, et al. The use of green fluorescence gene (gfp)-modified rabbit mesenchymal stem cells (rmscs) co-cultured with chondrocytes in hydrogel constructs to reveal the chondrogenesis of mscs[J]. Biomaterials, 2009,30(31):6374-85.

[13]Li N, Yang H, Lu L, et al. Comparison of the labeling efficiency of brdu, dii and fish labeling techniques in bone marrow stromal cells[J]. Brain Res, 2008,1215:11-9.

[14]毛雨红,莫碧文,李劳冬,等. 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及CM-DiI标记的实验研究[J]. 安徽医科大学学报, 2013,48(6):607-11.

[15]周六化,杨 斌,夏佳东,等. CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞可行性分析[J]. 南京大学学报(自然科学版), 2014,50(1):1-8.

Isolation, culture of rat adipose-derived stem cells and passage tracing after CM-DiI labelinginvitro

Zhou Hong,Guo Xing,Li Dan,et al

(DeptofBurnsandPlasticSurgery,TheAffiliatedHospitalofSouthMedicalUniversity,Luzhou646000)

ObjectiveToestablishamethodforisolation,cultureandcelllabelingofratadipose-derivedstemcells(ADSCs)andinvestigatethepassagetracingfeasibilityofCM-DiIlabeledADSCsin vitro.MethodsAdiposetissuewasharvestedfromtheinguinalfatpadofSprague-Dawleyratsundersterileconditions.Bymeansofcombiningzymogendigestionwithdifferentialvelocityadherence,theprimarycellswereisolated.Theywereusedonserialsubcultivation.Themorphologyofcellswasobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope.ThemolecularphenotypeanddifferentiationpotentialityofthreepassagedADSCswereidentified.ThreepassagedADSCswerelabeledbyCM-DiIandtheywereusedonserialsubcultivation.Fluorescencelabelingofcellswereobservedunderthefluorescenceinvertedmicroscopeandlaserscanningconfocalmicroscope.Thelabelingratewasdetectedbyflowcytometry.ResultsADSCsshowedlongspindleshapeandvortexlikegrowth.Afterpassages,thegrowthandproliferationrateofcellswereaccelerated.ThecellswereidentifiedpositiveforCD29andCD90makers,andtheyshowedthelackofCD34,CD45andCD31expressions.AlizarinredandoilredOstainingshowedADSCscouldbedifferentiatedtoosteoblastsandadipocytes.TheredfluorescenceofCM-DiIlabelingexistedinthecellmembraneandcytoplasm,whichdidnotexistinthecellnucleus.Afterpassages,thefluorescencewasattenuated,andthefluorescencelabelingratesofthethird,sixthandninthpassagewere97.09%, 66.21%and37.86%,respectively.ConclusionRatADSCscangrowandproliferaterapidly,andtheyhavemultipledifferentiationpotential.CM-DiIcanlabelADSCssimplyandeffectively.Thesecanprovidethebasisforthefollowingexperimentin vivo.

adipose-derivedstemcells;cellculture;CM-DiI;celllabeling

国家自然科学基金(编号：31271049)；四川省卫生厅科研课题(编号：090228)；泸州市科学技术局指导性科技计划项目 (编号：2010-6)

西南医科大学附属医院1整形烧伤科、2骨关节外科，泸州 646000

周 虹，女，硕士研究生； 郭 杏，女，副教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail:gx412@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.008.html

Q 813.1+1

A

1000-1492(2016)11-1590-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.008

2016-06-27接收