重楼皂苷Ⅰ对低氧喉癌Hep-2细胞增殖和HIF-1α、VEGF表达的影响

邓碧凡，廖 敏，邱荣敏，高 波，张云桂，马 燕，龙剑文



重楼皂苷Ⅰ对低氧喉癌Hep-2细胞增殖和HIF-1α、VEGF表达的影响

邓碧凡1，廖 敏1，邱荣敏1，高 波1，张云桂1，马 燕1，龙剑文2

目的 研究重楼皂苷Ⅰ对低氧喉癌Hep-2细胞增殖及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 采用MTT法检测重楼皂苷Ⅰ对细胞增殖的影响，实时定量PCR(RT-PCR)法检测低氧条件下重楼皂苷Ⅰ对Hep-2细胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表达的影响。采用Western blot法检测低氧条件下，重楼皂苷Ⅰ对Hep-2细胞VEGF、HIF-1α、信号传导与转录激活因子3(STAT-3), 磷酸化信号传导与转录激活因子3(p-STAT-3)蛋白表达的影响。结果 重楼皂苷Ⅰ对低氧喉癌Hep-2细胞的增殖有抑制作用；其中，1.5、3、6 μg/ml浓度组重楼皂苷Ⅰ可下调低氧Hep-2细胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达。同时，重楼皂苷Ⅰ抑制了STAT-3、p-STAT-3的表达。结论 重楼皂苷Ⅰ能抑制低氧条件下喉癌Hep-2细胞增殖和HIF-1α、VEGF的表达，可能与其下调STAT-3表达及抑制STAT-3的磷酸化有关。

重楼皂苷Ⅰ;Hep-2细胞;细胞增殖;HIF-1α; VEGF

喉鳞状细胞癌为常见头颈部恶性肿瘤，我国喉癌发病率约占头颈部肿瘤的13.9%，为全身恶性肿瘤的2.1%[1]。虽然近来喉癌治疗方式已有很大提高，但喉癌患者总的生存率仍然很低。喉癌的综合治疗已成为一种治疗趋势。寻找高效、低毒的抗喉癌药物十分重要。低氧是实体恶性肿瘤增殖中一种常见现象[2]，缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor 1-α，HIF-1α) 是喉癌肿瘤低氧中的中枢环节，调控相关基因的转录[3]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是促血管生成因子，目前是抑制肿瘤血管生成的主要靶点[4]。信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription3, STAT-3)参与肿瘤细胞的增殖，并可以调节HIF-1α和VEGF的表达[5]。重楼是中医治疗肿瘤的常用药物之一，目前研究[6]表明，重楼有效成分重楼皂苷Ⅰ对某些肿瘤细胞具有抑制作用，但对喉癌肿瘤细胞作用如何，目前暂无报道。该研究观察重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下喉癌Hep-2细胞增殖活性的影响，以及对低氧Hep-2细胞HIF-1α、VEGF和STAT-3表达的影响，探讨重楼皂苷Ⅰ治疗喉癌的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 重楼皂苷Ⅰ 粉剂(中国药品生物制品检定所)；Hep-2喉癌细胞株[中国科学院(上海)]；100 U/L青霉素、100 μg/L链霉素和MTT试剂盒(武汉博士德生物公司)；DMEM培养基、小牛血清和胰蛋白酶(美国 Gibco公司)；TRIzol总RNA提取试剂(美国 Invitrogen公司)；Quantonestep RT-PCR试剂盒、SYBR green荧光实时定量PCR试剂盒(北京天根生化公司)；多克隆兔抗VEGF、多克隆兔抗STAT3、多克隆兔抗HIF-1α、多克隆兔抗p-STAT3、β-actin试剂盒(美国Santa Cruz公司)；辣根酶标记抗兔lgG抗体(英国 Abcam公司)；辣根酶标记的β-actin抗体(上海兴悠生物科技有限公司)；ECL试剂盒(瑞典 Amersham Biosciences公司)。分光光度仪(芬兰 Multiskan MS公司)；细胞培养箱(美国 Thermo Electron公司)

1.2 细胞培养 将Hep-2细胞在37 ℃、5% CO2空气，含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10%胎牛血清的培养基内培养，在细胞聚集达60%～70%时，置于37 ℃，含1%O2、5%CO2、94%N2的低氧培养箱中继续培养36 h，提取细胞总RNA及总蛋白。

1.3 MTT法检测细胞增殖实验 将Hep-2细胞接种于96孔板(5×104个/孔)，细胞生长至60%～70%融合状态时，加入重楼皂苷Ⅰ，各组终浓度分别为0、0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml(预实验显示以上浓度对人角质形成细胞无细胞毒作用)，每组6个平行孔，低氧培养36 h，加入20 μl 5 mg/ml MTT，培养4 h，再加入DMSO振荡，调零，于酶标仪570 nm波长处检测各组的光密度(optical density, OD)值。细胞生长抑制率(IR)=1-OD1/OD2，OD1表示实验组细胞OD值，OD2表示空白对照组OD值，实验重复3次。

1.4 测定低氧条件下重楼皂苷Ⅰ对HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表达的影响 Hep-2细胞培养同1.3。设计相关基因上、下游引物，HIF-1α上游引物：5′-CAACCGGTTTAAGGACACATTCTG-3′,下游引物：5′-TCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTG-3′，扩增产物片段长度150 bp；VEGF上游引物：5′-AAGTGGTCCCAGGCTGCA-3′，下游引物：5′-CTCCAGGCCCTCGTCA-3′，扩增长度为216 bp；GAPDH上游引物：5′-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3′,下游引物：5′-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3′，扩增长度为141 bp。提取总RNA，反转录合成cDNA；取cDNA 1 μl，加入2.5×RealMasterMix/20×SYBR Solution 11.25 μl，上下游引物各为1 μl，加无Rnase水，反应体积共25 μl；PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，循环条件为95 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸50 s。采用ΔCt值法计算结果，ΔCt=样品的Ct均值-内参的Ct均值，2-ΔΔCt即为初始cDNA的相对含量。

1.5 Western blot法检测 Hep-2细胞培养同1.3，收集细胞，提取细胞总蛋白，用BCA法蛋白定量，上样，SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜，PBS洗膜，5%脱脂牛奶封闭l h；PBS洗膜，加一抗(兔抗VEGF 1 ∶500、兔抗STAT3 1 ∶500、兔抗HIF-1α 1 ∶500、兔抗p-STAT3 1 ∶400)，4 ℃过夜；PBS洗膜；加入二抗(辣根酶标记抗兔IgG抗体1 ∶3 000)孵育0.5 h，洗膜，采用ECL试剂盒检测。以β-actin为内参校正。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，组间均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 MTT法检测Hep-2细胞的生长活性 低氧条件下培养36 h后，重楼皂苷Ⅰ 6 μg/ml组(t=35.22，P<0.01)、3 μg/ml组(t=21.14，P<0.01)、1.5 μg/ml组(t=9.33，P<0.01)与空白对照组抑制率比较差异有统计学意义；3 μg/ml组(t=12.06，P<0.01)、1.5 μg/ml组(t=23.89，P<0.01)与6 μg/ml组抑制率比较差异有统计学意义。结果表明重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞的生长有抑制作用，其作用具有浓度依赖性。见图1。

图1 重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞增殖作用的影响 ×400

A：空白对照组；B～E：重楼皂苷Ⅰ 0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml组；与空白对照组比较：**P<0.01

2.2 重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表达的影响 与空白对照组比较, 6 μg/ml组(t=14.89,P<0.01)、3 μg/ml组(t=10.65,P<0.01)和1.5 μg/ml组(t=7.11,P<0.01)重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞HIF-1α mRNA表达均有抑制作用。与空白对照组比较，6 μg/ml组(t=17.21,P<0.01)、3 μg/ml组(t=12.84,P<0.01)和1.5 μg/ml组(t=7.83,P<0.01)重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞VEGF mRNA表达均有抑制作用。见图2。

2.3 重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞HIF-1α、VEGF、p-STAT3、STAT3表达的影响 与空白对照组比较, 6 μg/ml组(t=23.97,P<0.01)、3 μg/ml组(t=14.04,P<0.01)和1.5 μg/ml组(t=9.51,P<0.01) 重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞p-STAT3蛋白表达有明显抑制作用。与空白对照组比较, 6 μg/ml组(t=8.36,P<0.01)和3 μg/ml组(t=4.33,P<0.01)重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞STAT3蛋白表达有明显抑制作用。与空白对照组比较, 6 μg/ml组(t=23.03,P<0.01)、3 μg/ml组(t=18.58,P<0.01)和1.5 μg/ml组(t=13.21,P<0.01) 重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞HIF-1α蛋白表达有抑制作用。与空白对照组比较, 6 μg/ml组(t=22.56,P<0.01)、3 μg/ml组(t=13.00,P<0.01)和1.5 μg/ml组(t=9.09,P<0.01) 重楼皂苷Ⅰ对低氧Hep-2细胞VEGF蛋白表达有抑制作用。见图3。

图2 重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表达的影响

A：空白对照组；B～E：重楼皂苷Ⅰ 0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml组；与空白对照组比较：**P<0.01

3 讨论

由于喉癌肿瘤组织生长过快，肿瘤细胞往往存在低氧情况。研究[7]显示，随着低氧时间的延长，Hep-2细胞计数会逐渐增高。这说明一定程度的低氧会促进喉癌Hep-2细胞的增殖。经过重楼皂苷Ⅰ处理后，抑制了低氧诱导的Hep-2细胞的增殖，提示重楼皂苷Ⅰ具有抑制喉癌肿瘤细胞增殖的活性。以往研究[6]表明重楼皂苷Ⅰ对多种肿瘤细胞具有抑制作用，并能通过线粒体途径诱导耐药性肝癌细胞的凋亡。但在喉癌Hep-2细胞中，重楼皂苷Ⅰ是通过何种途径发挥抑制作用还需要进一步研究。

图3 重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下Hep-2细胞HIF-1α、VEGF、 p-STAT3、STAT3蛋白表达的影响

A：空白对照组；B～D：重楼皂苷Ⅰ 1.5、3.0、6.0 μg/ml组；与空白对照组比较：**P<0.01

研究[8]表明HIF-1α在细胞低氧中发挥重要作用，HIF-1是一种由HIF-1α和HIF-1β组成的异源二聚体。在正常情况下，HIF-1α通过羟基化而降解，低氧条件下，HIF-1α羟基化降解被抑制，与HIF-1β组成异源二聚体，转入核内调节靶基因的转录[8]。靶基因包括VEGF、促红细胞生成素、转铁蛋白、内皮素1、诱导型一氧化氮合酶和胰岛素样生长因子等[9]，从而促进肿瘤细胞的生长。VEGF是血管内皮细胞的特异性丝裂原，能够介导新生血管的形成，在喉癌的生长、侵袭中发挥重要作用[10]。且与喉癌的分化程度、淋巴结有无转移和TNM分期有关[11]。研究[12]表明重楼皂苷Ⅰ能够抑制低氧情况下Lewis肿瘤细胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达。本研究也表明重楼皂苷Ⅰ对低氧Hep-2细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达均有抑制作用。

在肿瘤中，各种蛋白激酶的活化已被证实，虽然不同的激酶转导途径不同，但STAT3在多数信号通路中发挥重要作用[13]，STAT3蛋白通过上调细胞凋亡抑制基因(如MCL1等)的转录和细胞周期调节蛋白(如MYC等)的表达，参与和促进肿瘤的发生[14]。STAT3的活化是许多恶性肿瘤的重要特征[15]。先前的一些研究[5]表明，STAT3对于HIF-1α表达是非常重要的，STAT3抑制剂能下调HIF-1α表达。STAT3也可通过诱导VEGF的产生参与肿瘤进展[16]。STAT3抑制剂能有效抑制VEGF生产与肿瘤血管的形成[5]。 Zhang et al[17]发现STAT3抑制剂AG490能明显抑制喉癌Hep-2细胞的增殖。本研究结果表明重楼皂苷Ⅰ能够下调低氧状态下喉癌Hep-2细胞STAT3的表达，并抑制STAT3的磷酸化。这可能是重楼皂苷Ⅰ抑制低氧喉癌Hep-2细胞增殖和HIF-1α、VEGF表达的原因之一。

综上所述，重楼皂苷Ⅰ能够抑制低氧喉癌Hep-2细胞增殖和HIF-1α、VEGF表达，这可能与其下调Hep-2细胞STAT3的表达，并抑制STAT3的磷酸化有关。

[1] 孔维佳.耳鼻咽喉头颈外科学[M].2版.人民卫生出版社，2010:460.

[2] Weljie A M, Jirik F R. Hypoxia induced metabolic shifts in cancer cells: moving beyond the Warburg effect[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2011, 43(7):981-9.

[3] Yu L,Liu Y,Cui Y. Expression of hypoxia inducible factor-1alpha and its relationship to apoptosis and proliferation in human laryngeal squamous cell carcinoma[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2004, 24(6):636-8.

[4] Grunstein J, Roberts W G, Mathieu-Costello O, et al. Tumor-derived expression of vascular endothelial growth factor is a critical factor in tumor expansion and vascular function[J]. Cancer Res,1999, 59(7): 1592-8.

[5] Xu Q, Briggs J, Park S, et al. Targeting Stat3 blocks both HIF-1 and VEGF expression induced by multiple oncogenic growth signaling pathways[J]. Oncogene,2005,24(36):5552-60.

[6] Cheung J Y, Ong R C, Suen Y K, et al. Polyphyllin D is a potent apoptosis inducer in drug-resistant HepG2 cells[J]. Cancer Lett, 2005, 217(2):203-11.

[7] Xu O, Li X M, Qu Y T, et al. Regulation of glucose transporter protein-1 and vascular endothelial growth factor by hypoxia inducible factor 1α under hypoxic conditions in Hep-2 human cells[J]. Mol Med Rep,2012,6(6):1418-22.

[8] Wang G L, Jiang B H, Rue E A, et al. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension[J]. Proc Natl Acad Sci,1995,92(12):5510-4.

[9] Elson D A, Ryan H E, Snow J W, et al. Coordinate up-regulation of hypoxia inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-1 target genes during multi-stage epidermal carcinogenesis and wound healing[J]. Cancer Res,2000,60(21):6189-95.

[10]Bonhin R G,Rocha V B,de Carvalho G M, et al. Correlation between vascular endothelial growth factor expression and presence of lymph node metastasis in advanced squamous cell carcinoma of the larynx[J]. Braz J Otorhinolaryngol,2015,81(1):58-62.

[11]瞿 帅,宋 杨,梅金玉,等. IL-17及其受体调控JAK/STAT3信号通路促进喉癌血管生成的作用[J].安徽医科大学学报,2015,50(10):1464-7.

[12]Ma D D, Lu H X, Xu L S,et al. Polyphyllin D exerts potent anti-tumoureffects on Lewis cancer cells under hypoxic conditions[J]. J Int Med Res,2009,37(3):631-40.

[13]Bowman T, Garcia R, Turkson J, et al. STATs in oncogenesis[J]. Oncogene, 2000,19(21):2474-88.

[14]Darnell J E Jr. STATs and gene regulation[J].Science,1997,277(5332):1630-5.

[15]Catlett-Falcone R, Dalton W S,et al. STAT proteins as novel targets for cancer therapy. Signal transducer an activator of transcription[J]. Curr Opin Oncol,1999,11(6):490-6.

[16]Niu G, Wright K L, Huang M, et al. Constitutive Stat3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesis[J]. Oncogene,2002,21(13):2000-8.

[17]Zhang H,Zhang D,Luan X, et al. Inhibition of the signal transducers and activators of transcription(STAT) 3 signaling pathway by AG490 in laryngeal carcinoma cells[J]. J Int Med Res,2010,38(5):1673-81.

Effect of Polyphylin I on proliferation and expressions of HIF-1α，VEGF in laryngeal carcinoma cell line Hep-2 under hypoxia

Deng Bifan, Liao Min, Qiu Rongmin, et al

(DeptofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,HezhouPeople′sHospital,Hezhou542899)

ObjectiveToinvestigatetheeffectsofPolyphyllinIonproliferationandexpressionsofHIF-1α,VEGFinlaryngealcarcinomacelllineHep-2underhypoxia.MethodsMTTassaywasperformedtoinvestigatetheeffectofPolyphyllinIontheproliferationofHep-2cellsunderhypoxicconditions.Real-timequantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionwasusedtodetecttheeffectofPolyphyllinIontheexpressionsofHIF-1αmRNAandVEGFmRNA.WesternblotwasusedtodetecttheeffectofPolyphyllinIontheexpressionsofVEGF,HIF-1α,STAT-3andp-STAT-3.ResultsPolyphyllinIinhibitedHep-2cellsproliferationunderhypoxiacondi-tion.PolyphyllinItreatment(1.5，3，6μg/ml)down-regulatedthemRNAandproteinexpressionsofHIF-1α,VEGFinHep-2cellsunderhypoxia.Meanwhile,PolyphyllinItreatmentinhibitedtheproteinexpressionsofSTAT-3andp-STAT-3inHep-2cellsunderhypoxia.ConclusionPolyphyllinIinhibitsHep-2cellsproliferationanddown-regulatestheexpressionsofHIF-1αandVEGFinHep-2cellsunderhypoxia.ItmayberelatedtoreducedSTAT-3expressionandinhibitionofthephosphorylationofSTAT-3inHep-2cellsunderhypoxia.

PolyphyllinI;Hep-2cell;cellproliferation;HIF-1α;VEGF

湖北省卫生计生委中医药、中西医结合科研指导性项目(编号：2013Z-B05)

1贺州市人民医院耳鼻喉头颈外科，贺州 5428992湖北中医药大学临床医学院，武汉 430061

邓碧凡，男，硕士，副主任医师，责任作者，E-mail:ljwhbzyy@qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.013.html

R 767.1

A

1000-1492(2016)11-1613-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.013

2016-06-15接收