枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

杨春艳，沈玺龙，张问平，袁时洁，吴拥军*

（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

杨春艳，沈玺龙，张问平，袁时洁，吴拥军*

（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2为材料，根据NCBI中菌株B.subtilis168的胺氧化酶（AMO）基因序列设计同源引物，克隆获得菌株B.subtilisBJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示，YobN基因开放阅读框（ORF）长为1 437 bp，编码478个氨基酸，分子质量为53.79 ku，与菌株B.subtilis168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体，获得重组菌pET28a-YobN/BL21，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22℃诱导5 h，表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础，对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。

枯草芽孢杆菌；胺氧化酶；基因克隆；基因表达

大豆起源于中国，大豆及其制品是东方食品的精华，是中国传统食品的“瑰宝”。我国传统豆制品制作历史悠久，品种非常丰富[1]。豆豉、腐乳、豆酱、酱油并称为我国四大传统发酵豆制品[2]。大豆蛋白质中含有人体必需的8种氨基酸，且具有多种保健功能[3]。

豆豉作为中国传统豆制品中的一种，现已发展成为驰名中外的地区品牌食品[4]。按发酵过程中主要微生物的不同，分为曲霉型、毛霉型和细菌型3种[5]。豆豉的生产主要以自然发酵为主，受生产条件的限制，带来了一系列食品安全隐患[6]。如在发酵生产过程中的部分菌株常因具有较高的氨基酸脱羧酶活性而导致产品中生物胺（biogenic amine，BA）的大量积累。适量的生物胺可起到促进生理活动、提高生理机能，但是过量的生物胺会引起生物体产生很多不良的反应，严重时甚至会导致生物体死亡。但目前我国对食品中生物胺的现行标准仅涉及鱼类制品中的组胺，对其他食品中的生物胺尚无限量标准[7-9]。豆豉作为贵州地区的一种特色食品，对贵州地区的经济发展具有重要作用。所以为保证地区特色经济的健康发展及发酵食品的安全性，有必要对豆豉产品中生物胺的控制进行进一步研究。

生物胺的代谢途径是一个复杂的过程，游离氨基酸在氨基酸脱羧酶的催化作用下形成生物胺[10-12]。目前认为去除食品中过量生物胺最有前景的方法是利用某些微生物产生的胺氧化酶降解生物胺[13-16]。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可作为豆豉工业生产菌株[17]，但其胺氧化酶活性研究较少。本研究以菌株B.subtilisBJ3-2为目标菌株，根据NCBIB.subtilis168菌株假定的胺氧化酶（amine oxidase，AMO）中基因序列YobN，设计特异性引物，以B.subtilisBJ3-2基因组DNA为模板PCR扩增，T载体克隆获得到pGEM-Yob N，测序验证正确后，亚克隆至pET-28a，以大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）为宿主菌，获得重组菌pET28a-YobN/BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）诱导表达后，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）电泳检测。镍柱纯化后获得AMO蛋白，可用于后期酶活测定及酶学性质的研究。通过控制豆豉发酵过程中的pH值、温度、盐浓度等因素可有效提高AMO活性，探索出AMO对生物胺中哪一种胺类物质的作用效果最大，从而降低豆类发酵食品中生物胺含量，提高其食用安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种和质粒

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α均为本实验室保藏菌株；宿主菌为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、表达载体pET28a：德国默克（中国）公司；克隆质粒pGEM-T载体：美国Promega公司。

1.1.2 PCR扩增引物

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增目的基因的名称及引物序列见表1。

表1 扩增目的基因的名称及引物序列Table 1 Name and primer sequence of amplified target gene

1.1.3 主要试剂

T4DNA连接酶（ligase enzyme）、溶菌酶：美国Promega公司；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）、DL2000DNAMarker、rTaqDNAPolymerase、限制性核酸内切酶、DNA连接试剂盒：TaKaRa（大连）公司；氨苄青霉素（ampicillin）、卡拉霉素（kanamycin）：北京索莱宝科技有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒：美国Omega公司；基因组DNA提取试剂盒：美国Promega公司。

1.1.4 培养基

LB培养基：配制方法见参考文献[18]。

1.2 仪器与设备

MyCycler PCR仪、Gel Doc XR凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司；DYY-4型稳压稳流电泳仪、DYCZ-25D小型垂直电泳槽（SDA-PAGE电泳槽）：北京六一仪器厂；SW-CJ-1FD标准型净化工作台：苏州净化设备有限公司；GMSX-280高压灭菌锅：英国阿斯太欧（Astell）公司；SHZ-82A气浴恒温振荡器：江苏荣华仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA的提取

挑取B.subtilisBJ3-2单菌落，接种到5 mLLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，参考Promega公司的革兰氏阳性细菌中提取基因组的试剂盒说明书提取B.subtilisBJ3-2全基因组。

1.3.2 PCR扩增胺氧化酶基因

以提取的B.subtilisBJ3-2基因组DNA为模板，使用PCR扩增引物进行目的片段的扩增。PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，10 μmol/μL Forward Primer 0.5 μL，10 μmol/μL Reverse Primer 0.5 μL，Template DNA 1.0 μL，rTaqDNA Polymerase 0.1 μL，ddH2O 14.3 μL，总体积20μL。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，58.5℃复性45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃、10min。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 重组质粒pGEM-YobN的构建及测序

PCR产物采用胶回收试剂盒进行纯化，纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接。连接及连接产物的转化方法按试剂盒操作说明书进行。将10μL连接产物按常规方法转化至E.coliDH5α感受态细胞中。挑选重组子提取质粒进行PCR鉴定测序。将阳性菌株提取质粒后送至Life Technologies公司进行测序。序列通过网站http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi的BLAST软件对基因序列进行在线比对分析，分析判定所克隆的基因是否为目的基因。将测序鉴定正确的重组质粒命名为pGEM-YobN。

1.3.4 重组表达载体pET28a的构建

将质粒pGEM-YobN及表达载体pET28a分别用BamH I（37℃）和XhoI（37℃）双酶切，将目的片段胶回收并纯化，用T4DNA Ligase enzyme将其与双酶切的载体pET28a连接。按照试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1中的说明书的使用方法进行连接。按摩尔比3∶1进行酶连，酶连产物转化E.coliDH5α。

1.3.5 目的蛋白的表达分析

将重组表达载体pET28a-YobN和空载体pET28a分别转化E.coliDH5α，将获得的转化子再分别接种到含有卡那霉素（kanamycin，Kan）的LB固体平板上划线，37℃恒温培养箱中过夜培养。从平板上挑取单克隆菌落，接种入5 mL含有卡那霉素（Kan）50 μg/mL的LB液体培养基中，37℃、180 r/min振荡培养过夜。次日将培养物离心，收集菌体，对菌体进行超声波破碎后离心（破碎条件为冰水浴、220 W、30 min、超声3 s间歇3 s），取上清10%进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测。

22℃温度条件下，用终浓度分别为0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L、1.50mmol/L、1.75mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在5 mL试管内进行小量诱导表达，诱导7 h。各取出1 mL加上样缓冲液经沸水煮20 min，12 000 r/min条件下离心10 min，取上清12%进行SDS-PAGE电泳检测。

1.3.6 重组蛋白的纯化及浓度测定

利用德国Novagen公司提供的His.Bind PurificationKit蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。最后用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。

2 结果与分析

2.1 B.subtilisBJ3-2基因组DNA的提取及PCR扩增

以菌株B.subtilisBJ3-2基因组DNA为模板，温度梯度PCR扩增YobN基因，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。由图1可知，在1～4号泳道均出现3条带，其中约1 400 bp处扩增条带与预期的YobN片段大小相符。

图1 目的基因PCR扩增电泳图Fig.1 Electrophoretogram of target gene by PCR amplification

2.2 重组质粒PCR的鉴定

胶回收目的DNA片段，T载体连接后转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α。菌落PCR鉴定为阳性的重组菌落接种LB培养基过夜培养，提取质粒DNA，并进行质粒PCR鉴定，结果见图2。由图2可知，在预期大小处出现特异性条带，说明目的基因已正确克隆至pGEM-T载体中，重组载体命名为pGEM-YobN。

图2 重组质粒PCR扩增电泳图Fig.2 Electrophoretogram of recombinant plasmid by PCR amplification

2.3 目的基因的序列分析

将质粒PCR均鉴定为阳性的重组质粒测序。结果表明，克隆基因全长1 437 bp，BioXM软件分析基因编码478个氨基酸残基，计算其蛋白质理论分子质量为53.79 ku，等电点为7.8，其中鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）含量为44.17%。将所克隆的基因序列与GenBank数据库进行序列Blast比对，结果表明，克隆得到的基因序列与B.subtilis168的假定胺氧化酶（amine oxidase，AMO）基因序列的同源性达到98%，说明所克隆的基因正确。

2.4 重组表达载体pET28a-YobN的构建及鉴定

将该基因与pET28a载体连接，双酶切验证结果见图3。由图3可知，酶切产物片段大小与克隆的基因大小相符。在一号泳道中出现了两个条带，其中较小的条带出现的位置大约在1 430 bp处，与目的基因（YobN）序列大小一致。这表明克隆的胺氧化酶基因与表达载体pET28a连接成功，即预期获得重组表达载体pET28a-YobN重组子。

图3 pET28a-YobN重组质粒酶切鉴定Fig.3 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET28a-YobN

2.5 目的蛋白诱导表达

22℃温度条件下，用终浓度分别为0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L、1.50 mmol/L、1.75 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在5 mL试管内进行小量诱导表达，诱导7 h。各取出1 mL经沸水煮20 min，SDS-PAGE电泳检测菌体裂解液，结果见图4。

由图4可知，在1号泳道中未添加诱导物的菌液蛋白基本不表达，在2～8号泳道中出现了很明显的蛋白条带，蛋白表达显著。通过软件Quantity One分析得出目的蛋白的分子质量大小约为53.79 ku，与推测的蛋白质分子质量大小相当，2～8号泳道的条带灰度值（trace值）大小分别为319、355、353、359、350、354、332 INT。因为5号泳道的trace值为最大，而此时用到的IPTG的浓度为1.0 mmol/L，所以得出浓度在1.0 mmol/L IPTG处的蛋白表达量最大。

图4 SDS-PAGE检测蛋白小量诱导表达结果(不同IPTG浓度)Fig.4 Induced expression results of protein by SDS-PAGE analysis (different IPTG concentration)

22℃温度条件下，用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG在5 mL试管内进行小量诱导表达，诱导时间分别为2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，菌体裂解液经SDS-PAGE电泳检测，结果见图5。

图5 SDS-PAGE检测蛋白小量诱导表达结果(不同时间)Fig.5 Induced expression results of protein by SDS-PAGE analysis (different time)

由图5可知，通过软件QuantityOne分析可得，trace值大小为199、238、243、253、254、296、306 INT，数值趋势大致为梯度增加，由此可知蛋白的表达量跟随诱导时间的延长而逐步提高，且在5 h后表达的蛋白浓度基本趋于稳定。由此可以推测，在相同的条件下，诱导时间是影响蛋白表达的主要因素。

2.6 目的蛋白提取、纯化

将重组菌液接种于500 mL含卡拉霉素（kanamycin）的LB培养基，摇瓶培养，以终浓度1 mmol/L IPTG，22℃诱导表达5 h。超声处理后的细胞混合裂解液、上清及未诱导的细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳检测。选取上清蛋白部分，利用His纯化试剂盒进行过柱纯化除去杂蛋白，结果见图6。

图6 纯化蛋白电泳图Fig.6 Electrophoretogram of purified protein

由图6可知，在预期大小附近均看到蛋白浓度较高的诱导表达带。根据软件QuantityOne分析可得四个泳道的trace值分别为438、552、418、389INT。比较1、2与3、4号泳道数值大小，两者差距不明显，说明目的蛋白在上清部分的含量较高，在沉淀中的含量较少，所以后续实验均取上清作为蛋白提取液。在5号泳道中目的蛋白纯化结果表明，蛋白与柱结合效果较好，用200 mmol/L的咪唑洗脱可获得较高浓度的蛋白。

2.7 目的蛋白浓度测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为标准蛋白质，以不同质量浓度蛋白质（X）为横坐标，吸光度值A595nm（Y）为纵坐标，绘制牛血清蛋白标准曲线，得出回归方程：Y=0.351 3X+0.002 1，相关系数为R2=0.998 5。按照回归方程计算样品中蛋白质质量浓度高达1.30 mg/mL，可用于后期酶活测定及酶学性质的研究。

3 结论

细菌型豆豉作为贵州地区一种广受大众喜爱的特色发酵食品，年产值达几十亿，如“老干妈风味水豆豉”等畅销国内外，对贵州地区的经济发展具有重要作用。现在豆豉的生产主要以自然发酵为主，因此会有多种微生物的参与。在很多这些微生物中都含有氨基酸脱羧酶，且豆类食品中含有非常多的游离氨基酸，所以通过对参与发酵微生物的分析发现食品中存在潜在的生物胺污染风险，尽管豆豉中毒事件已有不少报道，但生物胺引起的食品中度还未见关注。

生物胺合成的最主要的途径是氨基酸的脱羧反应，而胺氧化酶作为分解生物胺的关键酶，因此必须对胺氧化酶所对应的基因、表达量、及酶活性等等进行研究，最终使其大量表达，且具有较高的活性，从而降低发酵食品中生物胺的含量。本研究以枯草芽孢杆菌作为豆豉发酵过程中的主要菌种，研究成功克隆获得了菌株B.subtilisBJ3-2胺氧化酶基因YobN，并以pET-28a作为表达载体，1 mmol/LIPGT诱导表达纯化后获得1.30 mg/mL目的蛋白。作为胺氧化酶来说，它的活性受到温度、pH、NaCl等因素的影响，而生产实践中不仅要考虑这些因素对该酶活性的影响，还要面对很多食品辅料（如辣椒、花椒、味精等）对它的影响。因此，获得纯化的AMO对进一步深入研究其活性影响因素及酶学性质奠定了基础，对指导生产具有实际意义。

[1]励建荣.中国传统豆制品及其工业化对策[J].中国粮油学报，2005，20（1）：41-44.

[2]袁小娟.细菌型豆豉双菌发酵的工艺研究[D].重庆：西南大学，2011.

[3]傅艳华，王鹏程，阳庆华，等.大豆食品加工利用现状与发展前景[J].湖北农业科学，2001，26（1）：62-64.

[4]牛广财，贾亭亭，魏文毅，等.淡豆豉的研究进展[J].中国酿造，2013，32（9）：1-5.

[5]李平兰，王成涛.发酵食品安全生产与品质控制[M].北京：化学工业出版社，2005：4-13.

[6]黄欣，邓放明.豆豉的研究进展[J].中国食物与营养，2006（11）：20-22.

[7]刘景，任婧，孙克杰.食品中生物胺的安全性研究进展[J].食品科学，2012，33（5）：322-326.

[8]中华人民共和国农业部.NY5073—2006无公害食品、水产品中有毒有害物质限量[S].北京：中国标准出版社，2006.

[9]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员.GB 2733—2005鲜、冻动物性水产品卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2005.

[10]李志军，吴永宁，薛长湖.生物胺与食品安全[J].食品与发酵工业，2004，30（10）：84-91.

[11]苏国兴，刘友良.高等植物植体内的多胺分解代谢及其主要产物的生理作用[J].植物学通报，2005，22（4）：408-418.

[12]何庆华，吴永宁，印遇龙.食品中生物胺研究进展[J].中国食品卫生杂志，2007，19（5）：451-454.

[13]FADDA S,VIGNOLO G,OLIVE G.Tyramine degradation and tyramine histamine production by lactic acid bacteria andKocuriastrains [J].Biotechnol Lett,2001,23(24):2015-2019.

[14]LEUSCHNER R G K，HAMMES W P.Tyramine degradation by micrococci during ripening of fermented sausage[J].Meat Sci,1998,49(3): 289-296.

[15]MARIA L N,DAPKEVICIUSA E,ROBERT N M J,et al.Biogenic amine formation and degradation by potential fish silage starter microorganisms[J].Int J Food Microbiol,2000,57(1/2):107-114.

[16]MARTUSCELLI M,CRUDELE M A,GARDINI F,et al.Biogenic amine formation and oxidation byStaphylococcus xylosusstrains from artisanal fermented sausages[J].Lett Appl Microbiol,2000,31(3):228-232.

[17]贾东旭，吴拥军，李耀中，等.细菌型豆豉发酵芽孢杆菌的筛选与鉴定[J].食品科学，2009，30（5）：217-221.

[18]SAMBROOK J，RUSSELL D W.Molecular cloning:a laboratory manual[M].New York:Scholastic Corporation Press,2001.106-152.

Cloning and expression of amine oxidase genes fromBacillus subtilis

YANG Chunyan,SHEN Xilong,ZHANG Wenping,YUAN Shijie,WU Yongjun*
(College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using the bacterial type Douchi industrial fermentation strainBacillus subtilisBJ3-2 as a material,homology primers were designed according to the amine oxidase(AMO)gene sequence ofB.subtilis168 in national center for biotechnology information(NCBI),the AMOYobNgene ofB.subtilisBJ3-2 was cloned and obtained.The results of sequence analysis indicated that open reading frame length(ORF)ofYobNgene was 1 473 bp,which could encode 478 amino acids with molecular mass of 53.79 ku,and homology of YobN gene was 98%withB.subtilis168.The target gene was cloned into prokaryotic expression vector to obtain recombinant strain pET28a-YobN/BL21.The results of SDS-PAGE showed the target protein was induced with 1.0 mmol/L IPTG at 22℃for 5 h,and the expression of AMO was up to 1.30 mg/ml.The study laid the foundation for the research of AMO activity,and had important significance for the control of biogenic amines in fermented soy foods.

Bacillus subtilis;amine oxidase;gene clone;gene expression

Q936

0254-5071（2016）11-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.032

2016-08-24

国家自然科学基金项目（31260394/C200207）

杨春艳（1991-），女，硕士研究生，研究方向为微生物学。

*通讯作者：吴拥军（1971-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。