尾菜青贮乳酸菌的分离鉴定及其培养条件研究

邵建宁，彭章普，张文齐，麻和平，刘彩云，王洁，赵昊星

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

尾菜青贮乳酸菌的分离鉴定及其培养条件研究

邵建宁，彭章普，张文齐，麻和平，刘彩云，王洁，赵昊星

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

从泡菜中分离鉴定适合尾菜（废弃白菜叶、青笋叶）青贮的乳酸菌，获得产酸能力强、青贮效果好的2株菌株SD2和SD4，并对其培养条件进行研究。结果表明，菌株SD2、SD4最适培养温度分别为35℃、37℃；最适培养时间分别为20 h、16 h；最适初始pH值均为6.5；最适接种量均为6%。菌株SD2和SD4分别在30℃条件下进行尾菜发酵7 d后，pH值均＜4.0，乳酸菌活菌数＞1×108CFU/g。对菌株SD2和SD4进行形态学、生化检测及16S rRNA序列分析，鉴定菌株SD2为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。

尾菜；青贮；乳酸菌；分离鉴定；培养条件

随着我国蔬菜种植面积不断扩大和蔬菜种植布局不断集中，在蔬菜产区蔬菜采收与初加工过程中常伴有大量的尾菜产生，造成了环境污染[1-2]。为解决尾菜污染环境，实现尾菜资源化利用，对无腐烂变质的尾菜进行青贮饲料制备，可以降低尾菜的营养物质损失，较长期保存尾菜的青鲜状态，提高尾菜青贮饲料的适口性、消化率和营养价值[3-6]。青贮饲料是在厌氧条件下利用乳酸菌发酵产生乳酸，使青贮料pH值迅速下降，抑制其他耗氧微生物对青绿饲料营养成分的分解作用，并改善青贮饲料发酵品质，从而达到长期保存饲料营养物质的目的[7-9]。青贮过程中乳酸菌必须具备较强的产酸能力且达到一定数量，才能更好地发挥其生物功效。因此，筛选出产酸能力强、青贮发酵效果好的乳酸菌菌株，是制备优良青贮剂的核心，也是青贮成功的关键。目前，专门针对用于尾菜青贮的乳酸菌研究很少，自然青贮又不能保证尾菜青贮的品质，因此，分离鉴定可应用于尾菜青贮的优良乳酸菌非常重要。本实验从市售泡菜中分离乳酸菌，进行产酸性能、青贮发酵效果研究，筛选适合尾菜青贮的乳酸菌，对筛选到2株菌株的最适培养条件进行了研究，并通过形态学、生化检测及16S rRNA序列分析，对2株菌进行了鉴定。以期为尾菜青贮剂的研究开发与利用提供了参考和菌种保证。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种来源

实验菌株是本研究室从兰州市售泡菜中分离筛选出的菌株，由本研究室保藏。

1.1.2 培养基

MRS培养基[10]：酪蛋白胨10 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，吐温80 1 mL/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，琼脂粉15 g/L，蒸馏水1 L，pH 6.8。

MC培养基[11]：大豆蛋白胨5 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，乳糖20 g/L，CaCO310 g/L，琼脂粉15 g/L，中性红0.05 g/L，蒸馏水1 L，pH 6.0。

1.1.3 青贮原料

挑选无腐烂变质的废弃白菜叶、青笋叶进行清洗，切割成长2 cm、宽3 cm，晾晒，使废弃白菜叶、青笋叶水分含量降至70%左右备用。

1.1.4 化学试剂

蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉粉、大豆蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、乳糖：天津市百世化工有限公司；吐温-80：上海大众制药厂；K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3：北京化工厂。所用化学试剂为分析纯或生化试剂。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DELTA320pH计：梅特勒-托利多（METTLERTOLEDO）集团；UV-120-02型分光光度计：日本岛津公司；JA2003N电子天平：上海精密仪器有限公司；DG-1多功能培养箱：上海医疗器械修造厂；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；BH-2显微镜：日本奥林巴斯（OLYMPUS）公司。1.3方法

1.3.1 分离筛选

（1）乳酸菌分离与纯化

从采购的市售泡菜中取5 mL泡菜汁和45 mL无菌生理盐水，混匀，以10倍梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5三个稀释度，各稀释度取0.2 mL，分别均匀涂布于MC培养基平板上，30℃平板倒置培养48 h，选择菌落显红色，周围有明显溶钙环的单菌落进行保存。对分离的菌株在含有CaCO3的MRS培养基平板上划线分离纯化2～3次，挑取溶钙圈明显的单菌落，经镜检确认为纯种后，用MRS液体培养基培养，采用甘油法进行保藏[12]。

（2）乳酸菌初筛及复筛

初筛：将上述分离纯化的菌株活化后，按5%（V/V）接种量（菌种活菌数约为1×108CFU/mL）接入MRS液体培养基，置于30℃恒温培养箱培养24 h，每隔2 h无菌取样测定各菌株发酵液的pH值，根据发酵时间和pH值绘制产酸速率曲线。选择能在MRS液体培养基，16～20 h内发酵液pH值下降到4.0以下的菌株作为初筛菌株。

复筛Ⅰ：将初筛得到的菌株在30℃静置培养24 h，进行产酸量测定，采用酸碱滴定法中和法，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，计算产酸量，产酸量以吉尔涅尔度（°T）表示。

复筛Ⅱ：将复筛Ⅰ选出菌株培养液按质量比0.5%的接种量（菌种活菌数约为1×109CFU/mL），接种在预处理后的废弃白菜叶、青笋叶中。分别均匀喷洒到500 g青笋叶及500 g白菜叶中，装袋后压实、袋口密封，在30℃条件下发酵，测定尾菜青贮饲料pH值及活菌数，综合尾菜青贮饲料感官指标评价复筛菌株发酵性能[13]。

1.3.2 活菌数测定

（1）发酵菌液活菌数测定

取1 mL待测定发酵菌液，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选取10-6、10-7稀释梯度，吸取0.2 mL菌悬液置于MRS琼脂平板上，每个稀释梯度做3个平行，以灭菌的涂布器将菌悬液均匀涂开，然后将平板倒置于培养箱中，37℃条件下培养48 h，进行菌落计数[14]。

（2）尾菜饲料乳酸菌总数测定

取5 g尾菜青贮饲料和45 mL无菌生理盐水混匀，以10倍梯度稀释，选取10-5、10-6稀释梯度，吸取0.2 mL菌悬液用涂布棒涂布于MC琼脂平板上，培养48 h后，选择菌落显红色，周围有明显溶钙环的菌落进行计数。

1.3.3 pH值测定

发酵液pH测定：无菌取样5 mL，用pH计测定发酵液的pH值。

青贮尾菜pH测定：称取尾菜青贮样品20g，加入180 mL蒸馏水，使用组织捣碎机捣碎，然后用四层纱布和滤纸分别进行过滤，用pH计测定尾菜青贮样品过滤液的pH值。

1.3.4 培养条件研究

将培养温度分别设定为30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、42℃，初始pH值分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接种量分别按照1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%（V/V），用MRS液体培养基静置培养24 h，每隔2 h在波长600 nm条件下测定培养液的OD600nm值，考察培养温度、初始pH值、接种量及培养时间等因素对菌株生长的影响。每个实验条件做3个平行样取平均值。

1.3.5 菌种鉴定

（1）形态特征观察：将筛选获得的菌株分别涂布到MRS固体培养基，37℃条件下培养2 d左右，观察菌落特征，取典型菌落涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察细胞形态[15]。

（2）生理生化特性测定：对待鉴定菌株进行过氧化氢酶、吲哚、明胶试验及葡萄糖、木糖、水杨苷、七叶苷、麦芽糖、甘露醇、蔗糖碳水化合物发酵产酸试验[16]。

（3）16S rRNA基因序列分析：提取待鉴定菌株16S rRNA，引物为原核生物16S rRNA的通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3'。16S rRNA PCR产物全序列由上海派森诺生物科技有限公司测定，将测得的16SrRNA序列与NCBI GenBank中的已知序列进行同源性比较后，判定菌株种类，从而确定鉴定菌株的属种信息[17]。

2 结果与分析

2.1 分离筛选

2.1.1 分离纯化

本实验从采购的市售泡菜中进行乳酸菌分离纯化，从MC培养基选择菌落显红色，周围有明显溶钙环的单菌落进行保存，对分离菌株在含有CaCO3的MRS平板培养基上反复划线纯化，挑选出溶钙环明显的单菌落，经镜检确认为纯种，最终分离获得20株产酸菌株。

2.1.2 初筛

青贮要求在较短时间内青贮基质pH值迅速下降到4.0以下，这样才能有效抑制真菌及其他杂菌的生长。对分离纯化获得的20株菌株进行产酸速率试验，选择能在MRS培养液中16～20 h内发酵液pH值下降到4.0以下的菌株作为初筛菌株，经初筛后选出7株产酸量大、产酸快的菌株见图1。由图1可以看出，菌株SD2、SD4、SD5、SD13、SD14、SD16、SD17在20 h时培养液pH值均降到4.0以下，7株菌株的pH值变化趋势基本一致，在培养初期pH值的变化都不明显。8 h以后pH值下降较快，随着培养时间延长，pH值逐渐下降。

图1 初筛菌株在不同培养时间下pH变化Fig.1 pH changes of primarily screening strains at different culture time

2.1.3 复筛Ⅰ

图2 初筛菌株产酸能力测定结果Fig.2 Determination results of acid-producing ability of primarily screening strains

将初筛到的7株菌株在MRS液体培养基中30℃条件下静置培养24 h，进行产酸量测定，结果见图2。从图2可以看出，菌株SD2、SD4、SD14、SD16、SD17酸度均≥70°T，其中菌株SD2、SD4产酸量较高，酸度达到了75°T以上，复筛出5株产酸性能较好的菌株；SD5、SD13产酸量较低，酸度均＜70°T。因此，将菌株SD2、SD4、SD14、SD16、SD17进行下一步复筛。

2.1.4 复筛Ⅱ

将复筛Ⅰ选出菌株接种在预处理后的废弃白菜叶、青笋叶中，测定尾菜青贮饲料发酵7 d后的pH值及乳酸菌活菌数，综合尾菜青贮饲料感官指标评价复筛Ⅰ菌株发酵性能，结果见表1。由表1可知，从感官指标、pH值、乳酸菌活菌数量比较可见，菌株SD2、SD4发酵废弃白菜叶、青笋叶，发酵7 d，尾菜青贮饲料pH均＜4.0，乳酸菌数量＞1.0×108CFU/g，颜色、气味、质地等感官指标良好，适合用于尾菜青贮饲料的发酵。

表1 不同复筛菌株发酵青贮尾菜结果Table 1 Results of vegetable wastes silage fermented by different secondary screening strains

2.2 培养条件研究

2.2.1 不同培养温度对菌株生长的影响

将菌株SD2、SD4分别接种在装MRS液体培养基中，置于不同温度下静置培养24 h，测定培养液OD600nm值，考察不同培养温度对筛选菌株SD2、SD4生长的影响，结果见图3。由图3可知，菌株SD2在35℃条件下，培养液OD600nm值最高，因此，35℃是菌株SD2最适生长温度。菌株SD4在37℃条件下，培养液OD600nm最高，因此，37℃是菌株SD4最适生长温度。

图3 不同培养温度对菌株生长的影响Fig.3 Effects of different culture temperature on strains growth

2.2.2 不同初始pH对菌株生长的影响

将菌株SD2、SD4分别接种在不同初始pH的MRS液体培养基中，置于37℃条件下静置培养24 h，测定培养液OD600nm值，考察不同初始pH对筛选菌株SD2、SD4生长的影响，结果见图4。由图4可知，培养基初始pH过高或过低均不利于菌株的生长。SD2在初始pH 6.5培养基中，培养液OD600nm值最高，因此，选择pH 6.5为菌株SD2最适生长初始pH值。SD4在初始pH 6.5培养基中，培养液OD600nm值最高，因此，选择pH 6.5为菌株SD4最适生长初始pH值。

图4 不同初始pH值对菌株生长的影响Fig.4 Effects of different initial pH on strains growth

2.2.3 不同接种量对菌株生长的影响

图5 不同接种量对菌株生长的影响Fig.5 Effects of different inoculum on strains growth

将菌株SD2、SD4分别按不同接种量接种在MRS液体培养基中，置于37℃条件下静置培养24 h，测定培养液OD600nm值，考察不同接种量对筛选菌株SD2、SD4生长的影响，结果见图5。由图5可知，菌株SD2、SD4在接种量6%的条件下，培养液OD600nm值最高，因此选择菌株SD2、SD4最佳接种量均为6%。

2.2.4 不同的培养时间对菌株生长的影响

将株SD2、SD4分别在上述最适培养条件下的培养24h，考察不同培养时间对筛选菌株SD2、SD4生长的影响，结果见图6。由图6可知，菌株SD2培养约10 h进入对数生长期，培养20 h后进入稳定期；菌株SD4培养约8 h进入对数生长期，培养16 h后进入稳定期。因此，SD2、SD4的最佳培养时间分别为20 h及16 h。

图6 菌株SD2及菌株SD4生长曲线Fig.6 Growth curves of strain SD2 and strain SD4

2.3 菌株鉴定

2.3.1 形态观察

对筛选获得菌株SD2、SD4进行菌落形态和细胞形态观察，结果分别见图7及图8。由图7及图8可知，菌株SD2在MRS琼脂平板上，菌落灰白色，圆形，凸起，表面平滑，湿润，边缘整齐，直径2～3 mm。显微镜油镜下观察，菌体呈长杆状，单个，成对或成短链，革兰氏染色阳性。菌株SD4在MRS琼脂平板上，菌落微白色，圆形，扁平，湿润，边缘不规则，直径为1～2 mm。显微镜油镜下观察，细胞短杆状，单个、成对或链状排列，革兰氏染色阳性。

图7 菌株SD2(A)及菌株SD4(B)的菌落形态Fig.7 Colonial morphology of strain SD2(A)and strain SD4(B)

图8 菌株SD2(A)及菌株SD4(B)的细胞形态Fig.8 Cells morphology of strain SD2(A)and strain SD4(B)

2.3.2 生理生化检测

对筛选获得菌株SD2、SD4进生理生化检测，结果见表2。由表2可知，菌株SD2明胶液化、吲哚形成、过氧化氢酶试验均为阴性，葡萄糖、木糖、水杨苷、七叶苷、麦芽糖、甘露醇、蔗糖碳水化合物发酵产酸试验均为阳性。菌株SD4明胶液化、吲哚试验、过氧化氢酶试验，木糖、水杨苷、七叶苷、麦芽糖、甘露醇发酵产酸试验均为阴性，葡萄糖、蔗糖发酵产酸试验为阳性。从菌株菌落、菌体形态和革兰氏染色反应基础上结合生理生化检测结果，菌株SD2初步鉴定为植物乳杆菌，菌株SD4初步鉴定为发酵乳杆菌。

表2 菌株SD2及菌株SD4生理生化检测结果Table 2 Physiological and biochemical detection results of strain SD2 and strain SD4

2.3.3 16S rRNA测序

将菌株SD2、SD4的16S rRNA基因测序结果在NCBI Genbank进行BLAST比对，从基因序列同源性对比结果可知，菌株SD2与登录号FJ386491.1的16S rDNA基因序列相似性为100%，菌株SD4与登录号EU419593.1的16S rDNA基因序列相似性为99%，结合2株菌的菌落形态、菌体形态特征，生理生化试验结果，将菌株SD2鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentums）。

3 结论

从泡菜中分离筛选适合尾菜青贮的乳酸菌，通过产酸性试验和尾菜青贮发酵试验筛选出出SD2、SD4两株产酸能力强，青贮废弃白菜叶、青笋叶效果良好的菌株。在30℃进行尾菜青贮发酵，尾菜青贮饲料7 d后pH均低于4.0，尾菜青贮饲料乳酸菌活菌数大于1×108CFU/mL。

菌株SD2、SD4最适培养温度分别为35℃、37℃，最适培养基初始pH均为6.5，最适接种量均为6%，最适培养时间分别为20 h、16 h。两株菌在最适条件下培养20 h后pH值均能下降到pH 3.5以下，具有良好的尾菜青贮发酵潜能。

对筛选获得的菌株SD2、SD4经细菌形态学观察，生理生化特性检测及16S rRNA基因序列分析，菌株SD2鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentums）。

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Isolation,identification and culture condition of lactic acid bacteria for vegetable wastes silage

SHAO Jianning,PENG Zhangpu,ZHANG Wenqi,MA Heping,LIU Caiyun,WANG Jie,ZHAO Haoxing
(Institute of Biology,Gansu Provincial Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Lactic acid bacteria strain SD2 and SD4 which had a strong acid-producing ability and good silage effect on vegetable wastes(the waste Chinese cabbage leaves and endive sprout leaves)were isolated from pickles and identified,and their culture conditions were researched.The results showed that the optimum culture temperatures of strain SD2 and SD4 were 35℃and 37℃,respectively.The optimum culture times were 20 h and 16 h,respectively.The both optimum initial pH were 6.5.The both optimum inoculums were 6%.The strain SD2 and SD4 were proceeded vegetable wastes fermentation at 30℃,respectively.After 7 d,the both vegetable wastes silage pH were lower than 4.0,and the viable cell counts of lactic acid bacteria were more than 1×108CFU/g.The morphology,biochemical detection and 16S rRNA sequence of strain SD2 and SD4 were analyzed.The strain SD2 and SD4 were identified asLactobacillus plantarumandLactobacillus fermentum,respectively.

vegetable waste;silage;lactic acid bacteria;isolation and identification;culture condition

Q939.97

0254-5071（2016）11-0123-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.025

2016-09-02

兰州市科技计划项目（2012-2-143）

邵建宁（1971-），男，高级工程师，本科，主要从事生物工程应用基础研究工作。