山西老陈醋大曲中优良乳酸菌高密度培养条件优化的研究

李江涌，王如福*，张怀敏，邢晓莹，于迪，乔羽

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中030800）

山西老陈醋大曲中优良乳酸菌高密度培养条件优化的研究

李江涌，王如福*，张怀敏，邢晓莹，于迪，乔羽

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中030800）

该研究以山西老陈醋大曲中分离筛选得到的1株优良乳酸菌戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）为研究对象，以乳酸菌活菌数为评价指标，通过单因素试验设计研究培养条件（温度、起始pH、接种量）对该菌株生长繁殖的影响；并利用响应面法对该菌株进行高密度培养条件的优化。结果表明，优化后的最佳培养条件为：培养温度25℃，初始pH值6.67，接种量5.0%。在此条件下，乳酸菌活菌数为2.89×109CFU/mL。验证试验表明，实际值与理论值基本相符。

大曲；戊糖片球菌；培养条件；响应面法

山西老陈醋大曲以大麦和豌豆为原料经过多道工序加工而成，大曲是一种天然的培养基，其中的微生物包括霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、芽孢细菌等[1]。大曲是一个相对稳定的微生物生态系统，是山西老陈醋的物质基础、酶基础和微生物基础[2-4]。在山西老陈醋酿造过程中，乳酸菌能够利用葡萄糖等碳源进行同型或者异型乳酸发酵，并产生大量的乳酸及少量的甲酸、乙酸、丙酸等酸性末端产物，这些产物对其风味的形成发挥着重要作用[5]。近年来，有关乳酸菌应用于食醋酿造的研究大多数是在液体发酵过程中的应用。赵春燕等[6]利用醋酸菌、乳酸菌和酵母菌的协同发酵，有效减少了醋的刺激性酸味，且其酯香有所增加；蒋忠等[7]在液态深层法酿醋中加入乳酸菌和酵母菌，最终使得所酿醋不挥发酸和酯类含量分别提高了10.25倍和1.62倍，并且达到改善食醋感官品质的目的。

乳酸菌代谢产物对于山西老陈醋的重要作用表现在以下几方面：乳酸菌发酵葡萄糖形成的乳酸减轻了醋酸刺激性气味，使食醋的口感变得醇香柔和；乳酸菌产生的乳酸和部分醇类形成酯类物质，增加食醋的酯香；乳酸菌除了可以通过自身的初级代谢和次级代谢合成一些风味物质，其代谢中间产物丙酮酸还可作为其他众多风味物质的前体物质，赋予山西老陈醋浓郁的香味[8-9]；乳酸菌的活动产生大量乳酸还可以降低酿造过程中酒醅及醋醅的pH值，抑制杂菌的生长，保证食醋酿造的顺利进行。

响应面分析（response surface analysis，RSA）方法是基于数学和统计学的紧密结合，它把回归方法作为函数的估算工具，在多个因素试验中，用多项式将因素与响应值的关系函数化，并且对影响因素的各因子水平和其交互作用进行优化与评价[10-13]。该法可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，并且已经广泛地应用于培养基的优化以及各类发酵条件的优化中[14-19]。

本试验对分离自山西老陈醋大曲中的一株优良乳酸菌进行人工培养，测定其生物学特性，采用单因素及正交试验探索其在人工环境下的最佳生长条件，为规模化生产乳酸菌制剂提供理论基础，并为乳酸菌强化应用于山西老陈醋发酵过程中，从而为提高山西老陈醋乳酸含量提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），编号为L20，该菌株是本实验室从山西老陈醋大曲中分离、筛选，由本实验室保藏。

1.1.2 培养基

MRS肉汤培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、柠檬酸三胺2.0 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1 mL、蒸馏水1.0 L，121℃、20 min灭菌。

MRS琼脂培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、柠檬酸三胺2.0 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1 mL、琼脂粉15.0 g、蒸馏水1.0 L，121℃、20 min灭菌。

1.2 仪器与设备

DL-CJ-1ND型无菌超净工作台：北京东联哈尔滨仪器设备有限公司；SPX-100B-Z生化培养箱：北京瑞科中仪科技有限公司；ZQPL-200立式全温振荡培养箱：天津市莱博特瑞仪器设备有限公司；MCS-3020全自动高压灭菌器：日本三洋集团；722E可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；AR1140电子天平：上海皖衡电子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验设计

采用单因素试验设计方法，筛选最适培养方式、起始pH值、培养温度及接种量，然后使用3因素3水平的响应面分析法对培养条件进行优化。

1.3.2 菌株L20的活化与培养

将冷冻保藏的戊糖片球菌L20在室温下解冻后，无菌条件下接种到MRS液体培养基中富集，再按1%（V/V）比例转接到MRS液体培养基中，30℃恒温条件下培养，重复3次以恢复菌株活力[20]。戊糖片球菌L20充分活化后，以接种量1%（V/V）接入MRS液体培养基，于30℃恒温培养12 h得到种子液。

1.3.3 菌株L20生长曲线的测定

采用比浊法原理测定戊糖片球菌L20的生长曲线。取处于对数生长期的菌悬液，按1%接种量接种至灭菌的MRS液体培养基上，在30℃条件下培养，每间隔3 h取样测定OD600nm值，并记录数据，测定周期48 h，以发酵时间为横坐标，以OD600nm值为纵坐标，绘制菌株L20生长曲线。

1.3.4 乳酸菌数的测定

按照单因素试验要求，在不同培养方式、接种量、培养温度、起始pH值下，将戊糖片球菌L20接种至灭菌的MRS液体培养基上培养21 h后，取1 mL戊糖片球菌L20发酵液加入至9 mL无菌生理盐水中，依次做10倍梯度稀释液，选取2个适宜的连续稀释倍数培养液进行平板计数，每个稀释度做3个平行试验。

1.3.5 单因素试验

（1）培养方式对乳酸菌生长的影响

选用MRS培养基，按1.0%的接种量以厌氧、有氧和静置的培养方式分别在厌氧培养箱、恒温振荡水浴锅和恒温培养箱中培养21 h，培养温度为30℃，每种培养方式3个重复，测定L20乳酸菌活菌数取平均值。

（2）培养温度对乳酸菌生长的影响

将培养温度分别设定为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，将1.0%接种量接入培养液，不同温度下进行乳酸菌的培养21 h，培养后测定其活菌数，确定菌株生长的最适培养温度。

（3）培养基起始pH值对乳酸菌生长的影响

用1 mol/L的盐酸和1 mol/L的氢氧化钠将MRS肉汤培养基的起始pH分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，培养过程中不再调pH值，其他各条件与培养方式测定相同，培养21 h后，测定不同起始pH值条件下该菌株活菌数，确定最佳起始pH。

（4）接种量对乳酸菌生长的影响

将该乳酸菌株的接种量分别设定为1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、11.0%，调节培养基起始pH值为6.0，在培养温度为30℃条件下培养21 h，培养后测定活菌数，确定最适接种量。

1.3.6 响应面法优化乳酸菌的培养条件

在单因素试验基础上，以培养温度（A）、起始pH值（B）及接种量（C）为影响因素，以菌株L20活菌数（Y）为响应值，再采用3因素3水平的响应面分析优化菌株L20的培养条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 数据统计

采用Sigma plot 10.0软件对单因素试验结果的数据进行分析；用Design Expert软件中Box-Behnken试验设计方法及进程对响应面设计进行二次响应面的分析。

2 结果与分析

2.1 菌株L20在MRS培养基中生长曲线的测定

以菌株L20培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制菌株L20的生长曲线，结果见图1。

图1 菌株L20在MRS培养基上的生长曲线Fig.1 Growth curve of strain L20 in MRS medium

由图1可知，菌株L20在0～6 h期间OD600nm值增长缓慢，6～18 h菌株OD600nm值迅速增长，21 h以后菌株的OD600nm值几乎不变。这是由于菌体刚开始（0～6 h）处于延滞期，是菌体对培养基的适应阶段，菌体数量增长缓慢；6～18 h时菌体处于对数生长时期，菌体快速繁殖，菌体数量快速升高；到21 h进入稳定期；因此把菌株L20在MRS培养基中的稳定期，即21 h作为最佳收获期。

2.2 单因素试验

2.2.1 培养方式对菌株L20生长的影响

由图2可知，在MRS培养基中，菌株L20于30℃分别摇床培养（转速150 r/min）、静置培养、厌氧培养，21 h后菌株L20的活菌数分别为2.03×108CFU/mL、2.55×109CFU/mL、2.60×109CFU/mL。其中，静置培养和厌氧培养的活菌数均显著高于摇床培养，而且菌株静置培养和厌氧培养的活菌数差异均不显著（P＞0.05）。结果表明，培养方式对菌株L20的细胞生长量影响很大，静置培养和厌氧培养优于振荡好氧培养。本研究结果与蔡毅等[21]研究结果基本相符，因此，确定菌株L20采用静置培养。

图2 不同培养方式对菌株L20生长的影响Fig.2 Effects of cultivation methods on the growth of strain L20

2.2.2 培养温度对L20菌株生长的影响

由图3可知，培养温度为25℃、30℃、35℃时，菌株L20的活菌数较多，其中，30℃培养的活菌数略高于25℃和35℃培养的活菌数，但统计分析差异不显著；当温度达到40℃、45℃时，菌株L20的存活率显著下降，说明温度过高会抑制菌株L20的生长，但是该温度下不会影响菌株L20的存活，表明该菌株能适应山西老陈醋固态醋酸发酵的高温环境（45℃左右）。结果表明，在30℃培养时，菌株L20活菌数达到最大值2.73×109CFU/mL，当培养温度过高时，酶的活性受到抑制，故培养温度＞35℃时，菌株L20活菌数明显降低。因此，菌株L20的最适培养温度为30℃。

图3 培养温度对菌株L20生长的影响Fig.3 Effects of culture temperatureon the growth of strain L20

2.2.3 培养基起始pH对菌株L20生长的影响

图4 MRS培养基起始pH对菌株L20生长的影响Fig.4 Effects of initial pH of MRS medium on the growth of strain L20

由图4可知，菌株L20分别在起始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0梯度系列的MRS培养基中30℃静置培养21 h后，菌株L20的活菌数呈现先增高后下降的趋势，菌株L20最适生长的起始pH范围为6.0左右。在起始pH值为6.0时培养菌株L20所得的活菌数显著高于其他起始pH值组活菌数（P＜0.05），而且起始pH为6.0时，菌株L20活菌数最高为2.80×109CFU/mL。起始pH过低或过高（起始pH值为4或8时）会抑制菌株L20的生长。结果表明，起始pH值对L20乳酸菌活菌数生长量影响很大。因此，最终确定菌株L20的最适起始pH值为6.0。

2.2.4 接种量对菌株L20生长的影响

由图5可知，不同接种量培养后，菌株L20活菌数存在较大差异。菌株L20活菌数随着接种量的升高，呈现先增加后减少的总趋势，在接种量为3.0%时，活菌数达到最大值2.81×109CFU/mL。因此，选择3.0%接种量为宜。

图5 接种量对L20生长的影响Fig.5 Effects of inoculum on the growth of strain L20

2.3 响应面法优化培养条件

2.3.1 响应面试验设计及结果

在单因素试验的基础上，以培养温度（A）、起始pH值（B）及接种量（C）为影响因素，以菌株L20活菌数（Y）为响应值，通过Design-Expert.8.0.6的Box-Behnken的设计原理，对菌株L20的培养条件设计了3因素3水平试验，试验设计与结果见表2。

利用Design Export 8.0.6软件对表2数据进行分析，得到二次多元回归方程：Y=2.208×109-2.612×108A+7.888× 108B+2.750×107C+3.000×107AB-6.250×107AC-1.750× 107BC+1.710×108A2-1.112×109B2+1.385×108C2。对模型进行显著性检验，结果见表2。

表2 响应面分析试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments

由表3可知，模型F值=29.00，P＜0.000 1，说明该回归方程是极显著的。另外，失拟项不显著（P=0.322 4＞0.05），表明回归方程具有显著意义。回归模型的复相关系数R2=0.973 9，说明该模型与实际情况拟合程度较好。能反应97.39%的变化。故可以用该模型对菌株L20不同培养条件下的生长情况进行分析和预测。模型数据显示，一次项A、B及二次项B2影响极显著（P＜0.01），交互项AB影响显著（P＜0.05），但是，其他项对菌株L20的生长不显著（P＞0.05）。利用DesignExport8.0.6软件得到各个因素的最佳培养条件为培养温度25.00℃，起始pH值6.67，接种量5.0%，在该条件下获得的菌株L20活菌数理论值为2.99×109CFU/mL。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.2 响应面分析

为综合考察交互项对菌株L20活菌数的影响，对表2数据进行回归拟合，得到回归方程的等高线图和响应面图，结果见图6。由图6可知，培养温度（A）和起始pH值（B）之间的交互作用对菌株L20活菌数具有显著影响，其他因素之间的交互作用对菌株L20活菌数的影响不显著。这一结果与回归方程的交互项显著性分析结果相符。

图6 培养温度、起始pH值及接种量对菌株L20活菌数影响的等高线和响应面Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interactions between culture temperature,initial pH and inoculum on viable counts of strain L20

2.4 验证试验

为了验证上述相应面模型的有效性，以响应面分析得到菌株L20最佳的培养条件：培养温度为25.00℃，起始pH值为6.67，接种量为5.0%，在该条件下获得的菌株L20活菌数理论值为2.99×109CFU/mL。在该条件下进行3次平行试验，得到该乳酸菌活菌数实际值为2.89×109CFU/mL稍低于理论值2.99×109CFU/mL，说明采用响应面法优化菌株L20的培养条件是行之有效的。

3 结论

采用二次响应面分析优化后菌株L20的最佳培养条件为培养温度25.00℃、起始pH值为6.67、接种量5.0%。在该条件下，获得的活菌数实际值为2.89×109CFU/mL。为今后将该菌株强化于酿醋大曲或应用于山西老陈醋酿造过程中的后续研究提供理论基础和菌种培养条件信息。

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High density cultural conditions optimization of excellent lactic acid bacteria from Shanxi mature vinegar Daqu

LI Jiangyong,WANG Rufu*,ZHANG Huaimin,XING Xiaoying,YU Di,QIAO Yu
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Jinzhong 030800,China)

UsingPediococcus pentosaceus,an excellent lactic acid bacterium isolated fromDaquof Shanxi mature vinegar as research object,and lactic acid bacteria counts as evaluation index,the effects of temperature,initial pH,and inoculum on the viable counts were studied.High density culture condition ofP.pentosaceuswas optimized by response surface method,and the optimal conditions were as follows:culture temperature 25℃, initial pH 6.67 and inoculum 5.0%.Under these conditions,the count of lactic acid bacteria was 2.89×109CFU/ml.The verification tests results showed that the actual value was in accord with the theoretical value.

Daqu;Pediococcus pentosaceus;cultural conditions;response surface method

TS264.2

0254-5071（2016）11-0083-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.017

2016-08-21

山西省重点研发项目山西老陈醋产业关键技术开发与示范（2015-TN-10）

李江涌（1990-），男，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程。

*通讯作者：王如福（1960-），男，教授，博士，研究方向为发酵食品工艺、果蔬采后生理及贮运技术。