产葡萄糖氧化酶菌株的诱变筛选及遗传稳定性研究

辛国芹，董佩佩，汪祥燕，赵影，刘秀侠，徐海燕*，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

产葡萄糖氧化酶菌株的诱变筛选及遗传稳定性研究

辛国芹，董佩佩，汪祥燕，赵影，刘秀侠，徐海燕*，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

采用平板显色初筛、Underbofler滴定法复筛及紫外-硫酸二乙酯复合诱变的方法，从临沂果园土样中得到一株产葡萄糖氧化酶（GOD）活性较好的菌株，命名为Bla-6，其产GOD酶活为（10.50±0.25）U/mL，与原始菌株LPA-4产GOD酶活（6.75 U/mL）相比提高了55.57%。结合5.8S rDNA-ITS区序列系统进化、菌落形态、生长特性、菌体形态等确定其分类地位。结果表明，所得菌株Bla-6被鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger），经8代传代培养后，GOD酶活维持在10.5 U/mL左右，该菌株遗传稳定性较好。

葡萄糖氧化酶；黑曲霉；诱变；遗传稳定性

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一种需氧脱氢酶，最早在黑曲霉（Aspergillus niger）提取物中发现[1]。GOD广泛地分布于动物、植物和微生物体内，在有过氧化氢酶存在时，可专一性氧化葡糖糖成葡萄糖酸和过氧化氢。作为一种新型的绿色天然酶制剂，GOD在食品、工业、医药、养殖业、纺织漂染[2]和生物等领域应用十分广泛[3-7]。GOD安全、无毒副作用，2013年农业部将饲料级GOD生产菌株限定为青霉菌（Penicillium）和黑曲霉菌（Aspergillusniger）。国外对微生物发酵生产GOD酶制剂的发酵工艺研究将近30年，HATZINIKOLAOU D G等[8]研究发现黑曲霉发酵生产GOD酶活多在2～7 U/mL，活性普遍较低，无法满足生产需要。2002年，MIRON J等[9]研究发现通过黑曲霉发酵菌株浸没培养法可优化生产GOD。目前，受技术水平、仪器设备等因素的限制，我国工业生产GOD酶制剂存在成本高、稳定性及酶活性较差等问题。GOD应用广泛，是一种很有潜力的生物催化剂，因此如何获得高活性、高稳定性、高产量的GOD，解决高成本、难纯化等问题是当前研究的重点[10]，随着研究的不断深入，GOD的应用前景会更加广阔。如何更加经济有效地制备高纯度、高酶活、高稳定性的GOD是急需解决的问题。

紫外诱变和化学诱变法筛选获得GOD生产菌株是提高原始菌株产酶能力的有效方法。RAY S等[11]通过聚乙烯亚胺和紫外诱变处理黑曲霉孢子共得到1 976株突变株，其中黑曲霉AB1801产葡萄糖酸钙达120 g/L。朱洪菊[12]以初始GOD酶活为1.21 U/mL的黑曲霉菌株为出发菌株，通过紫外诱变、微波诱变处理，最终筛选出了一株酶活达到5.32 U/mL的突变株C3。朱运平等[13]以黑曲霉为出发菌株，通过紫外诱变、亚硝酸钠化学诱变及紫外-亚硝酸钠复合诱变三种方法筛选得到一株高产胞外GOD的突变株，产GOD酶活力达186.32 U/mL，为原始菌株的3.8倍，且产酶能力稳定。此外，定向突变获得高产GOD突变菌株的研究处于起步阶段，发展潜力很大。HOLLAND J T等[14]将黑曲霉GOD基因132位的苏氨酸定向突变成丝氨酸时，发现特异性常数kcat/Km升高较为显著，同时对底物亲和力仅降低3%。本研究从果园土壤中筛选产GOD的菌株，并采用紫外-硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）复合诱变筛选高产GOD的菌株，旨在为其应用于工业化发酵生产提供一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从山东省临沂市秋季桃园内多点混合采集深度为0～10 cm的土样。本试验所选用的平板分离培养基、斜面培养基及发酵培养基详见参考文献[15]。硫代硫酸钠（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；硫酸二乙酯（DES）（色谱纯）：上海谱振生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2F型超净工作台：江苏通净净化设备有限公司；HPX-9082MBE型数显电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHZ-CA型大容量振荡器：太仓市实验设备厂；FA-1004型电子分析天平：上海太平仪器厂；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 产GOD菌株的初筛

称取10 g采集的土样于带有玻璃珠的100 mL生理盐水中，振荡培养30 min，吸取1 mL土样上清液梯度稀释，涂布于平板分离培养基，28℃培养3 d后观察平板，将出现蓝色圈的菌株接种到斜面培养基上30℃培养2 d至产生黑色孢子，而后进行复筛。

1.3.2 产GOD菌株的复筛及GOD酶活测定

将斜面培养基上菌株接种于发酵培养基中，于30℃、180 r/min恒温摇床培养5 d，采用Underbofler滴定法[16]测定菌株产GOD酶活。

GOD酶活：测定发酵液经5 000 r/min离心10 min得粗酶液。取250mL三角瓶，加入2%葡萄糖磷酸缓冲溶液25mL及1 mL粗酶液，立即置于30℃水浴振荡1 h然后加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液终止反应，用0.1 mol/L HCl滴定剩余的NaOH，记录所消耗的HCl体积为A，空白组（CK）用1 mL蒸馏水替代粗酶液，其他操作相同，记录所消耗的HCl体积B，每个样品测定3个平行，取均值计算酶活。

GOD酶活=（B-A）×F×N×1 000/60

式中：A为中和NaOH所消耗的HCl体积，mL；B为空白组中和NaOH所消耗的HCl体积，mL；F为粗酶液稀释倍数，N为HCl浓度，mol/L；1 000为单位换算系数；60为反应时间，min。

GOD酶活的定义：在上述实验条件下每分钟催化氧化1μmol/L的葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位，以1μmol/min表示，即1 U/mL。

1.3.3 产GOD菌株的紫外-硫酸二乙酯复合诱变

将复筛菌株在斜面培养基上培养长满孢子后，用适量的无菌生理盐水洗脱斜面培养基上的孢子，置于三角瓶中，180 r/min振荡20 min后用脱脂棉过滤菌丝从而得到分散的单孢子悬液，血球计数法计算孢子数。

将孢子悬液均匀地铺于已灭菌7cm表面皿中，制成1mm左右的薄层，于超净工作台的紫外灯下照射15 s后，进行梯度稀释，稀释度为10-1～10-6。取10-4～10-63个稀释度的孢子悬液各0.2mL，涂布于斜面培养基平板上，30℃避光培养2～3 d。挑取平板上生长速度较快的单菌落接种到斜面培养基上，30℃培养至孢子产生，再通过发酵培养基测定菌株产GOD酶活。选取产酶活高的菌株进行保存。

以紫外线诱变所得产GOD酶活最高的菌株为出发菌株，进行硫酸二乙酯诱变。取5 mL经紫外线诱变的高产GOD酶活孢子悬液加入体积为25 mL的三角瓶中，再加入0.2 mL体积分数为50%的DES，振荡40 min，再加入0.5 mL的硫代硫酸钠（85%）终止反应。稀释梯度为10-1～10-6。取10-4～10-63个稀释度的孢子悬液各0.2 mL，涂布于斜面培养基平板上，30℃倒置培养2～3 d。挑取平板上生长速度较快的单菌落接种到斜面培养基上，30℃培养至孢子产生，再通过发酵培养基测定菌株产GOD酶活。选取产酶活高的菌株进行保存。

1.3.4 产GOD菌株的鉴定

采用5.8S rDNA-ITS区序列法对筛选到的产GOD酶性能较好的菌株进行鉴定，构建系统发育树。待测菌株培养3d后挑取菌至发酵培养基中，30℃、160 r/min振荡培养2 d，然后将菌丝过滤烘干，采用生工生物工程（上海）股份有限公司真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取待测菌的基因组总DNA。

采用引物ITS1与ITS4对5.8S rDNA-ITS区序列进行扩增，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增反应体系及反应条件详见参考文献[15]。将PCR扩增产物送北京博尚公司测序，在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI）中进行基本的局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对分析，用DNAMAN 6.0软件进行多重序列比较，用MEGA 3.1构建系统发育树。

1.3.5 遗传稳定性测定

将经过紫外-硫酸二乙酯复合诱变筛选得到的产GOD酶活最高的菌株连续8代传代培养后，观察菌株的生长性能、菌落形态，测定各代菌株产GOD酶活。

2 结果与分析

2.1 土壤样品中产GOD菌株的筛选

对果园土壤样品初步筛选分离得到16株产GOD的菌株，挑取初筛平板中蓝色反应圈较大的6株菌至斜面培养基30℃培养产生黑色孢子后转接至发酵培养基进行复筛，30℃、180 r/min振荡培养5 d后，采用Underbofler滴定法测定菌株产GOD酶活力，结果如表1所示。

表1 分离菌株产GOD酶活测定结果Table 1 Determination results of GOD activity produced by isolated strains

由表1可知，以菌株LPA-4产GOD酶活力最高，发酵5 d后发酵液中GOD酶活可达6.750U/mL，因此选定菌株LPA-4进行后续诱变试验。

2.2 诱变筛选结果

2.2.1 紫外诱变筛选结果

对土壤样品中筛选得到菌株LPA-4进行紫外诱变，筛选得到8株菌进行发酵培养，其GOD酶活测定结果如表2所示。

表2 紫外诱变菌株产GOD酶活测定结果Table 2 Determination results of GOD activity produced by UV-light mutagenesis strains

由表2可知，大部分菌株紫外诱变后与原始株LPA-4相比，产GOD性能无明显提高，菌株编号为LPA4-7的产GOD酶活最高，为（7.550±0.283）U/mL，选定菌株LPA4-7孢子悬浮液进行DES诱变筛选。

2.2.2 复合诱变筛选结果

对菌株LPA4-7孢子悬浮液进行DES诱变，然后梯度稀释涂布斜面培养基平板30℃培养，挑取生长速度较快的8株菌至斜面保存，并将这8株菌接种至液体发酵培养基，30℃、180 r/min发酵5 d，检测GOD酶活结果如表3所示。

由表3可知，经诱变后，酶活力较菌株LPA4-7提高的菌株有LPA47-3、LPA47-5、LPA47-8 3株，酶活分别比原始菌株LPA-4提高38.76%、55.57%、38.01%。诱变筛选的菌株LPA47-5酶活最高，相同条件下产酶性能在（10.501± 0.254）U/mL，将其命名为菌株Bla-6进行后续试验。

表3 复合诱变筛选结果Table 3 Screening results of compound mutagenesis

2.3 诱变株Bla-6遗传稳定性

诱变株进行8次传代培养，将诱变得到的高产菌株Bla-6连续转接8代，每传一代用摇瓶发酵液测定酶活，结果如表4所示。

表4 诱变菌株Bla-6遗传稳定性试验结果Table 4 Genetic stability test results of mutant strain Bla-6

诱变菌株存在遗传性能不稳定的风险，随着传代次数的增加产酶性能可能会有所减弱。由表4可知，诱变株Bla-6在1～8代范围内产GOD酶活较稳定，维持在10.5 U/mL左右，说明诱变菌株具有较好的遗传稳定性。

2.4 诱变株Bla-6的鉴定

2.4.1 诱变株Bla-6的生长特性

将菌株Bla-6纯培养物挑至平板分离培养基上于30℃培养48 h，观察菌落形态和在显微镜下菌株形态，结果见图1。由图1可知，菌落生长较快，初白色，产孢后表面黑色，呈粉末状。分生孢子头呈球形或近球形，黑色放射状，分生孢子梗长短不一，布满整个顶囊，褐色球形。

图1 诱变菌株Bla-6的菌落特征(a)和菌株形态(b)Fig.1 Colony characteristics(a)and strain morphology(b)of mutant strain Bla-6

2.4.2 PCR扩增结果

利用引物ITS1和ITS4，菌株Bla-6的ITS区基因PCR扩增到目的片段，在500 bp左右有1条明显的电泳条带，如图2所示。将扩增得到的PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行测序。

图2 菌株Bla-6的5.8S rDNA ITS区序列的PCR扩增产物电泳图Fig.2 PCR amplification product electrophoregram of 5.8 S rDNAITS sequence of strain Bla-6

2.4.3 目的菌株的系统发育分析

将目的菌株Bla-6的5.8S rDNA-ITS区序列在NCBI中进行BLAST分析，并下载相似性最大的序列和该属内代表种，利用MEGA3.1软件构建系统发育树（见图3）。

图3 菌株Bla-6的5.8S rDNA ITS区序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA ITS sequence of strain Bla-6

由图3可知，与GenBank数据库中曲霉菌相关菌株的ITS区基因序列JF838357.1、HQ850370.1等的5.8S rDNA-ITS区序列比较分析，发现其与曲霉属（Aspergillussp.）的黑曲霉菌（Aspergillus niger）亲缘关系最近，相似度达99%。综合菌株的菌落形态、生长特性、镜检形态及5.8S rDNA-ITS区序列系统进化分析，确定菌株Bla-6为黑曲霉（Aspergillus niger）。

3 结论

本研究采用平板显色法初筛和Underbofler滴定法进行复筛，从土壤样品中得到8株产葡萄糖氧化酶的菌株，通过紫外-硫酸二乙酯复合诱变筛选出一株产GOD酶活性能较好的诱变菌株Bla-6。经过8代传代培养，诱变菌株Bla-6具有产GOD酶性能较好的遗传稳定性。采用微生物发酵法生产酶具有在常温常压下完成，微生物容易培养、繁殖快，生产和设备投资较少，以及其设备泛用性较广的优点，故可在短时间内廉价的大量生产。该产葡萄糖氧化酶突变株遗传性状稳定，相同发酵条件下摇瓶产酶可达（10.501±0.254）U/mL，比原始菌株LPA-4（6.750 U/mL）提高了55.57%。该研究对产GOD菌株的筛选诱变方法的建立和对菌株产酶遗传稳定性的研究，为促进黑曲霉产葡萄糖氧化酶工业化生产，提高酶的应用质量，降低生产成本提供了科学依据。

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Mutation screening and genetic stability of glucose oxidase-producing strain

XIN Guoqin,DONG Peipei,WANG Xiangyan,ZHAO Ying,LIU Xiuxia,XU Haiyan*,GU Wei
(Shandong Baolai-leelai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

By preliminary screening of plate coloration,secondary screening of Underbofler titration method,a glucose oxidase-producing strain was obtained from Linyi orchard soil samples,and named as strain Bla-6.The glucose oxidase(GOD)activity produced by strain Bla-6 was(10.50±0.25) U/ml,which was 55.57%higher than that(6.75 U/ml)produced by original strain LPA-4.By the analysis of 5.8S rDNA-ITS gene sequence,colonial morphology,growth characteristics,and mycelial morphology,the results showed that the strain Bla-6 was identified asAspergillus niger.After subculture of 10 successive generations,the GOD activity maintained at about 10.5 U/ml,which showed that the strain had good genetic stability.

glucose oxidase;Aspergillus niger;mutation;genetic stability

Q939.97

0254-5071（2016）11-0069-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.014

2016-05-24

国家高技术研究发展计划‘863计划'子课题（2013AA102806）

辛国芹（1985-），女，助理研究员，硕士，主要从事基础微生态研究工作。

*通讯作者：徐海燕（1975-），女，高级畜牧师，本科，主要从事微生态制剂研发工作。