芬戈莫德通过鞘氨醇-1-磷酸信号通路抑制肝癌细胞迁移的实验研究

王忠夏 张广 曹胤 江春平

·论著·

芬戈莫德通过鞘氨醇-1-磷酸信号通路抑制肝癌细胞迁移的实验研究

王忠夏 张广 曹胤 江春平

目的 探讨鞘氨醇-1-磷酸（S1P）信号通路及其抑制剂芬戈莫德（FTY720）在体外实验中对不同侵袭潜能人肝细胞癌（HCC）细胞迁移能力的作用。方法 通过Real-time PCR和免疫印迹的方法比较低侵袭潜能HCC细胞MHCC-97L和高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H中S1P信号通路关键分子及下游促迁移信号通路的表达与活性水平。使用外源性S1P刺激MHCC-97L细胞，并使用siRNA干扰MHCC-97H细胞中S1P受体1（S1PR1）的表达，通过划痕愈合实验和Transwell实验检测HCC细胞迁移能力的变化。最后使用FTY720处理MHCC-97H细胞，观察S1P及其下游信号通路表达及活性的变化，并研究FTY720对MHCC-97H细胞迁移能力的影响。两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。结果高侵袭潜能MHCC-97H细胞中，S1PR1、鞘氨醇激酶1（SphK1）及鞘氨醇激酶2（SphK2）的相对表达量分别为5.94±0.78、1.64±0.30及1.48±0.28，高于低侵袭潜能MHCC-97L细胞的1.00±0.06、1.00±0.06及1.00±0.09，差异具有统计学意义（t = -10.96，-3.575，-2.841；P均< 0.05）。MHCC-97H细胞中S1PR1、SphK1及SphK2的蛋白表达水平及活性以及S1PR1下游与细胞迁移能力密切相关的Src、粘着斑激酶（FAK）和Janus激酶2（JAK2）/信号转导子和转录激活子3（STAT3）信号通路活性明显高于MHCC-97L细胞。外源性S1P可促进MHCC-97L细胞的划痕愈合能力。MHCC-97L的Transwell细胞迁移实验显示：S1P刺激组迁移过膜细胞数为（178.33±10.01）个/视野，显著多于空白对照组的（88.00±8.54）个/视野，差异具有统计学意义（F = 116.60，P < 0.01）。相反的，使用siRNA干扰MHCC-97H细胞中S1PR1表达后，细胞的划痕愈合能力受到明显抑制，Transwell实验显示：阴性对照组迁移过膜细胞数为（209.33± 4.51）个/视野，而S1PR1特异性siRNA转染组迁移过膜细胞数为（98.67±9.02）个/视野，显著少于阴性对照组，差异具有统计学意义（t =19.01，P < 0.01）。FTY720作为S1P通路抑制剂，同样抑制了MHCC-97H细胞的划痕愈合能力，Transwell实验同样显示：FTY720处理组迁移过膜细胞数为（58.67±6.03）个/视野，显著少于对照组的（203.33±10.41）个/视野，差异具有统计学意义（t = 20.833，P < 0.01）。FTY720的作用机制可能在于通过下调SphK1和S1PR1，抑制下游促迁移信号通路的活性，并进一步抑制HCC细胞的迁移。结论 S1P信号通路参与了HCC细胞的迁移，而FTY720作为一种具有抗HCC活性的免疫抑制剂，可能通过下调S1P及其下游信号转导，抑制HCC细胞的迁移能力。

癌，肝细胞； 鞘氨醇； 芬戈莫德； 细胞运动

肝癌是全球范围内位列肿瘤相关性死因第二位的恶性肿瘤，据世界癌症统计显示，全球约50﹪的肝癌发生在我国，居世界首位。目前肝癌是我国发病率排名第四、死亡率排名第三的恶性肿瘤，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占肝癌总数的70﹪~ 90﹪[1-2]。肝移植可同时切除HCC病灶并替换病变肝脏，因此成为了HCC治疗最有效的手段之一[3]。肿瘤的复发和转移是影响HCC肝移植术后患者预后的主要因素之一，即使在严格选择的患者中，移植术后复发转移率仍可达15﹪~20﹪[4]。在影响复发转移的诸多因素中，免疫抑制剂的使用起到了重要的作用。抗肿瘤免疫抑制剂雷帕霉素的使用已被证实有助于降低移植后HCC复发转移的风险[5]。因此，继续寻找和评价具有抗HCC作用的免疫抑制剂可能有助于进一步改善HCC肝移植的疗效。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）作为内源性脂质代谢产物，参与了免疫调节、肿瘤发生发展和侵袭转移等多种重要的生物学过程[6]。在肿瘤细胞中，S1P的生成催化酶鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）及鞘氨醇激酶2（sphingosine kinase 2，SphK2）常呈磷酸化的活化状态，较正常细胞产生更多的S1P。S1P与其最重要的受体之一：S1P受体1（S1P receptor 1，S1PR1）结合后，可进一步活化下游信号转导级联反应，使Src、黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）及信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化并激活，通过促进肌动蛋白重构、伪足形成、增加基质金属蛋白酶分泌等方式促进肿瘤细胞的迁移能力，参与肿瘤的侵袭转移等恶性生物学行为[6-9]。芬戈莫德（fi ngolimod，FTY720）是一种作用机制独特的新型免疫抑制剂，

它并不直接抑制淋巴细胞的激活和增生，而是通过调控S1P信号通路，使外周淋巴细胞归巢进入淋巴组织，并抑制激活的淋巴细胞活性，从而起到免疫抑制作用。近年来的研究还发现，FTY720具有较强的抗肿瘤作用[10]。因此，FTY720作为一种潜在的抗肿瘤免疫抑制剂，可能对于降低HCC肝移植术后复发转移风险具有积极的意义。由于细胞迁移是肿瘤复发转移中的重要生物学过程，本研究使用不同侵袭潜能的HCC细胞系，探讨了S1P信号通路及FTY720的干预对于HCC细胞迁移能力的影响。

材料与方法

一、主要材料与试剂

1.细胞系：低侵袭潜能人HCC细胞系MHCC-97L、高侵袭潜能人HCC细胞系MHCC-97H由复旦大学肝癌研究所惠赠，以含10﹪胎牛血清及100 U/ml青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基培养。

2.实验试剂：FTY720购自美国Selleck公司；S1P购自美国Cayman公司。Trizol RNA提取试剂购自美国Life Technologies公司；RNA逆转录试剂盒及SYBR Green Real-timePCR试剂盒购自日本TOYOBO公司；Real-timePCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。小干扰RNA（siRNA）由上海吉玛基因技术有限公司合成，Lipofectamine RNAiMAX转染试剂购于美国Life Technologies公司。S1P受体1（S1P receptor 1，S1PR1）一抗购自美国Santa Cruz公司；SphK1、磷酸化SphK1（p-SphK1）、SphK2、磷酸化SphK2（p-SphK2）一抗购自美国ECM Biosciences公司；Src及磷酸化Src（p-Src）、FAK及磷酸化FAK（p-FAK）、JAK2及磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3及磷酸化STAT3（p-STAT3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗均购自美国Cell Signaling公司；RIPA细胞裂解液购自南通碧云天生物技术公司。Transwell细胞培养小室购自美国Corning公司。

二、实验方法

1.Real-time PCR检测人HCC细胞系S1P信号通路关键分子的表达水平：分别培养低侵袭潜能及高侵袭潜能人HCC细胞系MHCC-97L、MHCC-97H，收集细胞后使用Trizol试剂提取细胞总RNA，并通过逆转录反应制备细胞cDNA，通过SYBR Green法使用Life Technologies公司Viia-7 Realtime PCR仪检测两种人HCC细胞系中S1P信号通路关键分子的表达水平，以上操作均按照相应试剂盒说明书进行。

2.免疫印迹法检测HCC细胞内S1P信号通路关键分子的表达及活化情况：取各组处理后细胞加入RIPA裂解液，于4℃下孵育20 min，随后于4℃下12 000 × g离心20 min，取上清液，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液后95℃变性5 min。制备十二烷基磺酸钠-丙烯酰胺凝胶，每孔上样总蛋白20 μg进行电泳分离，随后使用半干式转印槽将凝胶中蛋白转印至聚偏二氟乙烯（poly vinylidene fl uoride，PVDF）膜上，以5﹪脱脂牛奶封闭1 h后加入一抗，4℃下缓慢摇动过夜，TBS-T洗膜3次，每次10 min。加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h后，TBS-T洗膜3次，每次10 min。使用化学发光法在天能5200化学发光系统中显影。

3.siRNA转染：针对S1PR1 mRNA序列设计siRNA，siRNA序列为：5'-CUGCUCAAGACCGUA AUUATT-3'。以不针对任何已知基因的乱序siRNA作为阴性对照。在超净工作台中按Lipofectamine RNAiMAX试剂盒说明书进行操作。在一离心管中加入适当体积的Opti-MEM无血清培养基，再加入适量S1PR1 siRNA或阴性对照siRNA后混匀。取另一离心管，加入与上一步相同体积的Opti-MEM，按说明书所示剂量加入Lipofectamine RNAiMAX脂质体转染试剂并混匀。将两离心管中液体混合并混匀，静置5 min后加入细胞培养基，继续培养48 h后进行进一步实验。

4.外源性S1P刺激HCC细胞：S1P以含0.5﹪去脂肪酸牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的无菌PBS溶解为母液备用，进行外源性S1P刺激实验时加入上述S1P溶液至培养基，使其终浓度为200 nmol/L，并使用不含S1P的BSA溶液作为阴性对照。

5.细胞划痕愈合实验检测HCC细胞迁移能力：将HCC细胞接种于6孔培养板，培养至细胞完全贴壁并生长至100﹪融合。在生物安全柜中以无菌移液器吸头在细胞上划痕，保持各组划痕宽度一致，吸去培养基，以无菌PBS洗3次，去除脱落的细胞后加入无血清培养基，倒置显微镜下拍照留存。按实验所需方法处理细胞，放回培养箱继续培养48 h，

观察划痕相同位置愈合情况，并拍照留存。

6.Transwell实验检测HCC细胞迁移能力：取8 μm孔径的Transwell小室放置在24孔板中，以人纤维粘连蛋白（Fibronectin）包被小室下侧面。消化细胞并计数，以无血清培养基重悬5×103个细胞接种于Transwell小室上室，下室加入含10﹪胎牛血清的完全培养基。进行实验所需处理后继续培养48 h，用棉签擦净Transwell小室上室内细胞，甲醇固定小室下侧面细胞，以0.2﹪结晶紫染色后，显微镜下计数迁移后细胞，并拍照留存。

三、统计学分析方法

使用PASW Statistics 18.0软件进行统计学分析，S1PR1、SPHK1、SPHK2相对表达量及Transwell实验迁移过膜细胞数以± s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），并采用Dunnett法与空白对照组进行两两比较，P < 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、不同侵袭潜能人HCC细胞S1P信号通路分子表达与活性水平的比较

Real-time PCR结果显示，低侵袭潜能MHCC-97L细胞中，S1P信号通路的重要受体S1PR1相对表达量为1.00±0.06，而在高侵袭潜能的MHCC-97H细胞中，S1PR1相对表达量为5.94±0.78，差异具有统计学意义（t = -10.96，P < 0.01）。同样的，在MHCC-97L细胞中，催化S1P生成的关键酶SPHK1和SPHK2相对表达量为1.00±0.06和1.00±0.09，而在MHCC-97H中，SPHK1和SPHK2的相对表达量分别为1.64±0.30和1.48±0.28，差异同样具有统计学意义（t = -3.575，-2.841；P = 0.023，0.047）。因此，相比于低侵袭潜能HCC细胞MHCC-97L，高侵袭潜能HCC细胞中，S1PR1、SPHK1、SPHK2均呈高表达状态（图1）。

图1 Real-time PCR法检测低侵袭潜能HCC细胞MHCC-97L及高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H中S1P信号通路关键分子的表达

同样，免疫印迹实验显示，高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H中S1PR1、SphK1及SphK2的蛋白表达水平显著高于低侵袭潜能MHCC-97L细胞。并且SphK1和SphK2在MHCC-97H细胞中呈磷酸化形式，提示酶的活性处于活化状态（图2）。进一步的，MHCC-97H细胞中，受S1PR1调控且与细胞迁移能力密切相关的Src、FAK和JAK2/STAT3信号通路蛋白磷酸化水平明显高于MHCC-97L细胞，提示在高侵袭潜能HCC细胞中上述通路处于激活状态（图3）。

二、调控S1P信号通路可影响HCC细胞的迁移能力

使用外源性S1P刺激低侵袭潜能MHCC-97L细胞后，使用划痕愈合实验检测细胞迁移能力显示：相比于空白对照及阴性对照组，200 nmol/L浓度的S1P显著促进了HCC细胞的划痕愈合能力（图4）。同样的，使用Transwell法检测细胞迁移能力显示：200 nmol/L浓度的外源性S1P明显促进了HCC细胞的迁移能力（图5），对迁移过膜细胞数量进行统计显示（图6），空白对照组、阴性对照组及S1P刺激组间迁移过膜细胞数存在显著差异（F = 116.60，P <

0.01）。阴性对照组和S1P刺激组分别与空白对照组进行两两比较显示：空白对照组迁移过膜细胞数为（88.00±8.54）个/视野，阴性对照组迁移过膜细胞数为（90.33±5.51）个/视野，两组间没有显著

差异（P = 0.92）；而S1P刺激组迁移过膜细胞数为（178.33±10.01）个/视野，与空白对照组相比存在显著差异（P < 0.01）。

图2 免疫印迹法检测低侵袭潜能HCC细胞MHCC-97L及高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H中S1P信号通路关键分子在蛋白水平的差异

图3 免疫印迹法检测低侵袭潜能HCC细胞MHCC-97L及高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H中受 S1PR1 调控的下游信号通路激活水平

图4 倒置显微镜观察S1P促进低侵袭潜能HCC细胞MHCC-97L的划痕愈合能力 （×40）

图5 倒置显微镜观察S1P促进低侵袭潜能HCC细胞MHCC-97L的迁移能力 （结晶紫染色×200）

图6 S1P刺激MHCC-97L细胞后Transwell迁移过膜细胞数

图7 免疫印迹法检测siRNA 转染高侵袭潜能 MHCC-97H细胞后 S1PR1 的表达

相反的，使用siRNA的方法转染MHCC-97H细胞后，免疫印迹的结果提示S1PR1特异性siRNA显著抑制了S1PR1的表达，而与空白对照相比，阴性对照siRNA对S1PR1的表达无明显影响（图7）。

使用S1PR1特异性siRNA干扰高侵袭潜能MHCC-97H细胞后，使用划痕愈合实验检测细胞迁移能力显示：相比于乱序siRNA转染阴性对照组，S1PR1特异性siRNA显著抑制了HCC细胞的划痕愈合能力（图8）。而使用Transwell法检测细胞迁移能力显示：S1PR1干扰明显降低了HCC细胞的迁移能力（图9），对迁移过膜细胞数量进行统计显示（图10），阴性对照组迁移过膜细胞数为（209.33± 4.51）个/视野，而S1PR1特异性siRNA转染组迁移过膜细胞数为（98.67±9.02）个/视野，显著少于阴性对照组，差异具有统计学意义（t = 19.01，P < 0.01）。

三、FTY720通过抑制S1P信号通路抑制HCC细胞迁移能力

使用S1P信号通路抑制剂FTY720处理高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H，划痕愈合实验的结果显示：5 μmol/L浓度的FTY720显著抑制了高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H的划痕愈合能力（图11）。而使用Transwell法检测细胞迁移能力也显示：FTY720处理明显降低了HCC细胞的迁移能力（图12），对迁移过膜细胞数量进行统计显示（图13），对照组迁移过膜细胞数为（203.33± 10.41）个/视野，而FTY720处理组迁移过膜细胞数为（58.67±6.03）个/视野，显著少于对照组，差异具有统计学意义（t = 20.833，P < 0.01）。

使用0、1，2.5，5，7.5，10 μmol/L浓度的FTY720处理MHCC-97H细胞24 h后，通过免疫印迹方法检测S1P信号通路关键分子的表达量及活化情况。结果显示，FTY720可剂量依赖性的下调SphK1及S1PR1，并进一步对于S1PR1调控的促迁移信号通路Src、FAK及JAK2/STAT3的磷酸化具有抑制

作用，这可能是其抑制HCC细胞迁移的潜在机制（图14）。

图8 倒置显微镜观察干扰S1PR1抑制高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H的划痕愈合能力 （×40）

图9 倒置显微镜观察干扰S1PR1抑制高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H的迁移能力 （结晶紫染色×200）

图10 S1PR1特异性siRNA转染MHCC-97H细胞后Transwell实验迁移过膜细胞数

讨 论

免疫抑制剂的使用是肝移植术后必要的治疗手段，但也与移植术后HCC的复发密切相关[11]。雷帕霉素是目前临床唯一可用的抗肿瘤免疫抑制

剂，对于预防肝移植术后HCC复发具有有益的作用[12]。因此，寻找和评价兼具抗肿瘤作用的免疫抑制剂对于改善HCC肝移植的预后具有积极的意义。芬戈莫德（FTY720）是一种作用机制独特的免疫抑制剂，通过抑制S1P信号通路，促进循环淋巴细胞归巢淋巴组织并抑制激活的淋巴细胞活性，发挥免疫抑制作用[13]。S1P信号通路不仅参与机体免疫调节，也调控了恶性肿瘤的诸多重要生物学行为。细胞内SphK1和SphK2催化产生S1P，而S1P进一

步与其受体结合，启动下游信号转导。作为S1P受体之一，S1PR1通过激活下游的Src[8-9]、FAK[7,14]和JAK2/STAT3[14-15]等信号通路，促进细胞迁移，从而参与恶性肿瘤的复发和转移过程。

图11 倒置显微镜观察FTY720抑制高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H的划痕愈合能力 （×40）

图12 倒置显微镜观察FTY720抑制高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H的迁移能力 （结晶紫染色×200）

图13 FTY720处理MHCC-97H细胞后Transwell实验迁移过膜细胞数

图14 FTY720 抑制高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H促迁移信号通路的活性

本研究的结果显示，相比于低侵袭潜能的同源细胞系MHCC-97L，高侵袭潜能的MHCC-97H细胞中，SphK1/2和S1PR1在mRNA和蛋白水平呈显著高表达状态，且作为催化S1P形成的关键酶，SphK1/2处于活化状态。更为重要的是，受S1PR1调控且与促进肿瘤迁移密切相关的Src、FAK和JAK2/STAT3信号通路在高侵袭潜能HCC细胞中呈激活状态，提示S1P及其下游信号通路可能与HCC细胞的迁移能力密切相关。本研究使用相同基因背景的不同侵袭能力HCC细胞，初步建立了S1P及其促迁移信号通路活化情况与HCC细胞迁移能力的相关性，上述结果还需在不同侵袭转移状态HCC临床样本中进一步研究加以验证。

进一步的，使用S1P刺激低侵袭潜能的MHCC-97L细胞可显著增强其迁移能力，而相应的在高侵袭潜能的MHCC-97H细胞中干扰S1PR1的表达抑制了高侵袭细胞的迁移能力。提示S1P通过S1PR1调控下游信号通路，促进HCC细胞的迁移，进而可能参与其临床复发和转移。FTY720作为S1P信号转导的抑制剂，其抗肿瘤药理作用可能包括通过下调SphK1和S1PR1的活性和表达水平，从而抑制S1P相关信号转导，显著抑制下游Src、FAK及JAK2/STAT3通路的活性，并进一步通过下调上述通路对于肌动蛋白重构、细胞伪足形成及基质金属蛋白酶分泌等的调控[8-9,14-16]，对HCC细胞的迁移能力产生抑制。

本文的结果和已有的证据证明，FTY720可直接抑制SphK1在蛋白水平的表达，或通过下调其酶活性，使得S1P产生减少。另外，FTY720作为S1P类似物，还可以降低受体S1PR1的表达。因此，FTY720可从S1P生成酶和受体两个水平同时抑制S1P信号转导[13,16-18]。本研究还提示，高侵袭潜能HCC细胞中SphK1不仅表达量高于低侵袭潜能HCC细胞，且处于磷酸化的活化形式。由于FTY720可下调SphK1的蛋白表达总量，因而无论SphK1的磷酸化活性如何，FTY720均可通过抑制SphK1产生S1P的作用，下调S1P相关信号转导，但FTY720是否通过影响SphK1的磷酸化影响其酶活性也是值得研究的话题。与SphK1不同，SphK2主要位于细胞核，目前对于其功能了解尚不清楚。SphK2可能通过产生S1P，在细胞核内参与调控组蛋白的乙酰化，进而影响基因表达[19]。FTY720对于SphK2是否存在直接的药理作用也不完全明确，本研究结果提示SphK2的表达及活性同样可能与HCC细胞的迁移能力相关，因此SphK2是否直接参与HCC细胞迁移及FTY720对SphK2的表达和酶活性是否存在调节作用同样值得进一步探讨。

综上所述，本研究的结果表明，S1P及其下游信号通路参与了HCC细胞的迁移。而FTY720作为S1P信号抑制剂，对HCC细胞迁移具有显著的抑制作用。FTY720兼具抗肿瘤和免疫抑制的活性[16]，因此可能对于改善HCC肝移植术后的临床预后具有一定的意义，值得进一步通过动物实验和临床研究深入探讨其临床价值。

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Immunosuppressant fingolimod inhibits the migration of hepatocellular carcinoma cells throughsphingosine-1-phosphate signaling pathway

Wang Zhongxia, Zhang Guang, Cao Yin, JiangChunping. Department of Hepatobiliary Surgery, the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, China

Objective To investigate the effects of fingolimod (FTY720), an inhibitor

Carcinoma，hepatocellular； Sphingosine； Fingolimod； Cell movement

2016-05-23）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.002

国家自然基金项目（81572393，81602093）；南京市医学科技发展重点项目（ZKX15020）；江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20160118）；中央高校基本科研业务费专项资金（021414380215、021414380242、021414380258）

210008 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科

江春平，Email: chunpingjiang@163.com

of sphingosine-1-phosphate (S1P) signaling pathway, on the migration of hepatocellular carcinoma (HCC) cells with different invasive ability in vitro. Method The expression of S1P signaling pathway molecules was compared using Real-time PCR and immunoblotting in highly invasive HCC cell line MHCC-97H and less invasive HCC cell line MHCC-97L. Exogenous S1P was used to stimulate MHCC-97L cells and siRNA transfection was used to interfere the expression of S1P receptor 1 (S1PR1) in MHCC-97H cells. The ability of migration was observed using wound healing assay and transwell assay. Finally, MHCC-97H cells were treated with FTY720. After treatment, the expression of S1P signaling pathway molecules were determined by immunoblotting. Data among multiple groups were compared by one-way ANOVA and data between two independent groups were compared by t-test. Result Relative expression of S1PR1, sphingosine kinase 1 (SphK1) and sphingosine kinase 2 (SphK2) were significantly higher in MHCC-97H HCC cells as compared with MHCC-97L cells (5.94±0.78 versus 1.00±0.06, 1.64±0.30 versus 1.00±0.06 and 1.48 ±0.28 versus 1.00±0.09, t = -10.96, -3.575, -2.841；P < 0.05). The protein levels of S1PR1, SphK1, SphK2 in MHCC-97H cells were also higher than those in MHCC-97L cells. Accordingly, the expression of S1PR1 downstream molecules Src, focal adhesion kinase (FAK) and Janus kinase 2(JAK2)/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) were also upregulated in MHCC-97H cells. Exogenous S1P promoted wound healing of MHCC-97L cells. As indicated by Transwell assay, migrated cell number in the S1P group was 178.33±10.01 per field, which was significantly more than that in the control group (88.00±8.54 per field, F = 116.60，P < 0.01). In contrast, interfering the expression of S1PR1 in MHCC-97H cells by siRNA inhibited wound healing and, as indicated by Transwell assay, migrated cells in S1PR1 siRNA group was 98.67±9.02 per field, which was significantly less than that in the negative control group (209.33±4.51 per field, t =19.01, P < 0.01). As an inhibitor of S1P pathway, FTY720 also inhibited wound healing ability of MHCC-97H cells. Similarly, in Transwell assay, migrated cell number in FTY720 group was significantly smaller than that in the control group (58.67±6.03 per field versus 203.33±10.41 per field, t = 20.833，P < 0.01). FTY720 inhibited S1P-mediated signaling transduction by down-regulating SphK1 and S1PR1, which inhibited the migration of HCC cells. Conclusion S1P signaling pathway participates in the migration of HCC cells. As an immunosuppressant with anti-HCC activity, FTY720 inhibits the migration of HCC cells through S1P signal pathway.

王忠夏,张广,曹胤,等. 芬戈莫德通过鞘氨醇-1-磷酸信号通路抑制肝癌细胞迁移的实验研究[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版, 2016, 6(5):270-279.