脐带血干细胞对慢乙肝失代偿期肝硬化的临床疗效

王丽华陈玉梅李炳茂孙建顺杨彬张丽贤

·论著·

脐带血干细胞对慢乙肝失代偿期肝硬化的临床疗效

王丽华1陈玉梅1李炳茂2孙建顺1杨彬1张丽贤1

目的 观察经肝动脉注入脐带血干细胞治疗慢乙肝肝硬化的临床疗效。方法 纳入60例慢乙肝肝硬化失代偿期患者，经肝动脉注人脐带血干细胞（2 ~ 6）×107，观察治疗后1周、4周、12周、20周肝功能[白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、凝血酶原活动度（PTA）]水平变化；检测第20周血清肝纤维化指标[层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原PC-Ⅲ、Ⅳ型胶原Ⅳ-C]改善情况，上述两种指标采用配对t检验，同时观察临床症状（食欲、精力、体力情况）及体征（水肿、腹水情况）的改善情况。结果 全部病人均顺利完成治疗，治疗后未出现严重不良反应及并发症；治疗12周时多半患者食欲、精力、体力改善至正常水平，双下肢浮肿、腹腔积液等体征消失，治疗后1周血ALT、AST较治疗前增高（t = 2.289，2.603；P = 0.026，0.012）、ALB较治疗前降低（t = 2.352，P = 0.022），TBIL较治疗前略高（t = 1.985，P = 0.052），PTA较治疗前略低（t = 1.924，P = 0.059），但差别无统计学意义（P > 0.05）；治疗后4周ALT、AST、ALB、PTA、TBIL均恢复至治疗前水平；治疗后12周ALT、AST（t = 2.259，P = 0.028）较治疗前降低（t = 2.565，2.259；P = 0.013，0.028），PTA较治疗前升高（t = 2.572，P = 0.013），ALB较治疗前明显改善（t = 20.04，P < 0.001），TBIL较治疗前略低（t = 1.962，P = 0.055），无统计学意义（P > 0.05）；20周后各项指标ALT、AST、ALB、PTA、TBIL及肝纤四项均改善（t = 10.13，8.652，26.686，6.385，4.194，P均< 0.001）。结论 经肝动脉注入脐带血干细胞治疗慢乙肝肝硬化近期有效。

脐血干细胞； 肝硬化； 肝炎，乙型，慢性

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是导致肝硬化的主要原因之一，失代偿期肝硬化往往由代偿期肝硬化隐匿发展而至，一些相关因素可导致病情发展。乙型病毒性肝炎急性发作可导致大约14﹪代偿期肝硬化患者进展为失代偿期，表现为肝硬化急性失代偿。失代偿期肝硬化为肝病终末期，目前肝移植被认可是肝病终末期的唯一有效方法，但肝脏来源稀少、移植费昂贵和长久使用抗免疫制剂等原因限制了其广泛应用，近来随着干细胞与再生医学兴起，发现脐带血干细胞移植可以代偿部分肝功能，现将我科近年来临床研究作以下报道。

资料与方法

一、一般资料

1.病例选择的标准：（1）依据相关症状、体征以及辅助检查确诊为慢乙肝失代偿期肝硬化患者，肝功能Child-pugh分级A、B、C级（年龄超过18岁，低于70岁）；（2）病因学明确的HBV感染证据；（3）目前只靠药物治疗效果不明显；（4）向患者家属及患者本人讲解后，并详细了解脐带血干细胞治疗的风险，仍同意接受治疗并签署脐带血干细胞治疗知情同意书。

2.排除标准：（1）其他引起肝硬化的常见病因如丙型病毒性肝炎感染、饮酒、药品等也需经过询问病史或相关的检查进行确定或排除；（2）并存肝、心、肾、肺等重要器官功能衰竭或血液病患者；（3）原发性肝癌；（4）感染；（5）其它器官恶性肿瘤；（6）休克、生命体征不稳定及不能配合操作者；（7）有严重过敏史者或高度过敏体质。

依据上述原则选择2009年10月至2014年10月哈励逊国际和平医院消化内科明确的慢乙肝失代偿期肝硬化患者60例，其中男48例，女12例；年龄40 ~ 66岁，中位年龄（54.56±6.39）岁；ChildpughC级14例，B级46例。入院后均给予患者常规保肝药物及利尿治疗1周，停用保肝药物后给予脐带血干细胞治疗，治疗前行肝功能化验、病毒检测、腹部CT检查并予以排除肝癌。

二、方法

1.分离：无菌采取脐带血（经伦理委员会批准，脐带血取自健康足月顺产新生儿脐血，每份60 ~ 120 ml，采集前产妇需做梅毒抗体、HIV抗体、乙肝五项、丙肝抗体、肝功能、支原体等检测全部合格后方可采集），断脐后1 ~ 2 min内采集，于采集后12 h内分离出0.5 ml细胞悬液，分选出脐带血干细胞数量为（2 ~ 6）×107应用于临床输注。

2.移植：应用利多卡因麻醉，采用改良Sildinger技术，穿刺右侧股动脉超选肝固有动脉，行数字减影血管造影以排除早期肝癌，将脐带血干细胞悬液约12 ~ 16 ml按1:1比例用生理盐水稀释后经导管以1 ml每分钟的速度缓慢注入，手术完成后拔出导管，穿刺部位给予加压包扎，右下肢制动24 h。

3.观察指标：（1）记录手术后第1周、4周、12周、20周临床症状改善情况；（2）治疗后第1周、4周、12周、20周观察肝功能[白蛋白（albumin，ALB）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、凝血酶原活动度（prothrombin time activity，PTA）]变化；（3）手术后第20周观察血清肝纤维化指标，包括[层粘连蛋白（laminin，LN）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、Ⅲ型前胶原PC-Ⅲ、Ⅳ型胶原Ⅳ-C]改善情况；（4）观察治疗后不良反应发生情况。

三、统计学分析方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料（ALB、TBIL、ALT、AST、PTA）及（LN、HA、Ⅲ型前胶原 PC-Ⅲ、Ⅳ型胶原Ⅳ-C）变化以x ± s表示，采用配对t检验进行组内比较，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、成功率及不良反应

60例患者均被成功将脐带血干细胞注入至肝固有动脉，手术成功率为100﹪；没有发现严重并

发症及不良反应，治疗后轻度发热4例，均在24 h内自行改善，且无肝区疼痛、出血、局部感染等情况发生。

二、临床症状改善情况

治疗后1周时40例患者食欲、乏力较前有所好转，但腹胀、腹水、双下肢水肿无好转，第4周时，38例患者精力、体力、食欲恢复正常，不再需要输注ALB，双下肢水肿消失，腹胀、腹水有所改善，但肝功指标未得到明显好转；治疗后第12周52例患者精力、体力、食欲恢复正常，腹胀、腹水等情况消失，肝功能指标较前改善。

三、肝功能与术前对比

肝功能较前改善，1周后ALT、AST较治疗前增高，ALB较治疗前降低（P < 0.05），TBIL均值较治疗前略高，PTA较治疗前略低但差异无统计学意义（P > 0.05）；4周后ALT、AST、ALB、PTA、TBIL均恢复至治疗前水平；12周后ALT、AST较治疗前降低（P < 0.05），PTA较治疗前升高但仍低于正常值（P < 0.05），ALB较治疗前明显改善（P < 0.01），TBIL治疗后较治疗前略低，差异无统计学意义（P > 0.05）；20周后各项指标较治疗前明显改善（P < 0.05或P < 0.01）（表1 ~ 4）。

表1 脐带血干细胞治疗前与治疗后1周肝功能对比情况（± s）

表1 脐带血干细胞治疗前与治疗后1周肝功能对比情况（± s）

组别ALT（U/L）AST（U/L）ALB（g/L）TBIL（μmol/L）PA（﹪）治疗前51.63±5.7348.62± 5.6429.18±3.5046.72±10.4454.60±14.39治疗后 1周53.70±6.8852.37±12.87 27.80±4.8447.15±10.3353.90±13.08 t 值2.2892.6032.3521.9851.924 P值0.0260.0120.0220.0520.059

表2 脐带血干细胞治疗前与治疗后4周肝功能对比情况（± s）

表2 脐带血干细胞治疗前与治疗后4周肝功能对比情况（± s）

组别ALT（U/L）AST（U/L）ALB（g/L）TBIL（μmol/L）PA（﹪）治疗前51.63±5.7348.62±5.6429.18±3.5046.72±10.4454.60±14.39治疗后 4周50.45±4.1747.73±7.5429.51±3.4646.00±12.0454.93±13.37 t 值1.6621.3441.7891.6650.180 P值0.1020.1840.0790.1010.858

表3 脐带血干细胞治疗前与治疗后12周肝功能对比情况（± s）

表3 脐带血干细胞治疗前与治疗后12周肝功能对比情况（± s）

组别ALT（U/L）AST（U/L）ALB（g/L）TBIL（μmol/L）PA（﹪）治疗前51.63± 5.7348.62± 5.6429.18±3.5046.72±10.4454.60±14.39治疗后12周47.63±10.7044.67±13.6636.47±1.4744.98±11.6758.17± 9.98 t 值2.5652.25920.041.9622.572 P值0.0130.0280.0000.0550.013

表4 脐带血干细胞治疗前与治疗后20周肝功能对比情况（± s）

表4 脐带血干细胞治疗前与治疗后20周肝功能对比情况（± s）

组别ALT（U/L）AST（U/L）ALB（g/L）TBIL（μmol/L）PA（﹪）治疗前51.63±5.7348.62± 5.6429.18±3.5046.72±10.4454.60±14.39治疗后20周39.62±8.1535.05±11.9839.91±3.5441.82±10.4363.32± 9.05 t 值10.1308.65226.6864.1946.385 P值0.0000.0000.0000.0000.000

表5 脐带血干细胞治疗前后血清肝纤维化指标对比（± s）

表5 脐带血干细胞治疗前后血清肝纤维化指标对比（± s）

组别HA/（ng/L）PCⅢ/（ng/L）IV-C/（ng/L）LN/（ng/L）治疗前171.56±55.58170.58±48.21168.95±48.97169.69±54.43治疗后20周148.44±30.43153.98±32.54147.22±39.00147.29±40.89 t 值 3.1152.6662.5893.412 P值0.0030.0100.0120.001

血清肝纤维化指标对比第20周时血清透明质酸HA、层黏连蛋白LN、Ⅲ型前胶原PC-Ⅲ及Ⅳ型胶原Ⅳ-C与治疗前比较有统计学差异（P < 0.05，表5）。

讨 论

乙肝肝硬化是慢性乙型肝炎病毒感染的重要临床结局，据世界卫生组织（WHO）调查，2002年关于全球死于肝硬化的患者，其中约30﹪患有乙型肝炎病毒感染，中位生存期为10 ~ 12年。一旦进展为失代偿，患者往往出现由门脉高压所致的食管胃底静脉曲张破裂出血、腹腔积液、肝性脑病、脾功能亢进、肝肾综合征等严重并发症，死亡风险明显增加[1]，由于乙肝肝硬化难治性，已成为各国学者普遍关注的问题，目前肝移植是治疗终末期肝病的最佳方法，但供体缺乏、费用高等因素限制了其推广，因此，寻求肝移植以外的有效治疗手段成为大家不断追求的目标。近来研究发现，脐带血干细胞具有定向分化、增殖的潜能，在肝脏微环境下能分化为肝细胞，可对损伤肝脏组织进行修复和重构，改善肝功能[2-3]，脐带血干细胞，作为一种全能细胞，具有多项分化潜能，与骨髓相比，免疫原性相对较弱，能够更大程度耐受HLA配型不符，移植抗宿主病发生相对较低，故脐带血干细胞作为一种新的替代细胞来源，具有极大优势和潜力[4]。

本实验患者脐带血干细胞治疗后1至4周食欲、乏力、腹胀等临床症状开始逐步改善，腹水及双下肢水肿逐步改善，术后12周明显改善，术后1周ALT、AST较术前增高，ALB较术前降低，考虑与肝动脉穿刺对肝脏暂时性刺激有关，上述指标均在术后4周时恢复至术前水平，提示脐带血干细胞注入肝固有动脉后从定植到分化为肝细胞约需4周时间，与杨彦林[5]报道相一致；术后12周时较术前明显好转，但转氨酶仍未恢复正常值，术后20周转氨酶恢复正常，说明使转氨酶恢复正常可能需20周时间或更长时间，转氨酶升高代表肝细胞损伤，可能机制为20周后脐带血干细胞在肝内进一步增殖、分化、修复损伤肝细胞，使其肝脏腺泡细胞数量增加达到改善肝功能效果；同时脐带血干细胞亦可能与体内的肝细胞“融合”，从而促使基因重排而行使了肝细胞的功能[6]。TBIL术后1 ~ 12周变化均不明显，与以往报道[7-8]相似，20周后胆红素水平得到改善，可能因为胆红素升高代表肝脏大量细胞功能减退，受损坏死，干细胞移植只能代替部分肝功能，完全修复坏死肝细胞可能需要更长时间；随着时间延长，各项肝功能均逐步改善，至20周时各项肝功能均达到正常范围，这表明脐带血干细胞从植入肝脏到转化为肝细胞和胆管细胞完全取代坏死肝细胞需要20周或更长时间或反复干细胞移植，这需要进一步大样本、多中心、临床研究。

本研究发现20周时血清学纤维化指标均得到了明显改善，这说明随着时间延长脐带血干细胞可以改善肝脏纤维化程度，可能由于脐血干细胞促进纤维化肝脏血管新生，改善血液供应，从而促进肝窦重建和肝再生[9]，这一结果仍需进一步大样本临床验证。

本实验全部患者均圆满完成治疗并顺利出院，无严重不良反应及并发症。虽然邵珺等[10]发现1例患者行脐带血干细胞治疗后并发了自发性肾周出血，但在本组患者中并未有相似发现。

从本研究结果来看，脐血干细胞移植可以改善肝功能，但其机制及对肝组织损伤修复的确切作用和途径如何尚未明确，脐血干细胞经提取后是进行直接体内移植还是体外培养经纯化后进行移植、最佳剂量、移植的最佳时间、移植次数、途径、移植的条件和适应证尚无统一标准，脐带血干细胞治疗后的近期疗效和远期结局仍缺乏客观的循证证据，是否会具有致瘤作用，均是将来各国学者需要进一步研究和解决的问题。

1 茅益民. 乙肝病毒相关肝硬化临床诊断和治疗综合管理[J]. 中华肝

脏病杂志, 2014, 22(5):327-333.

2 Bassiouny AR, Zaky AZ, Abdulmalek SA, et al. Modulation of AP-endonuclease1 levels associated with hepatic cirrhosis in rat model treated with human umbilical cord blood mononuclear stem cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2011, 4(7):692-707.

3 Shi LL, Liu FP, Wang DW. Transplantation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells improves survival rates in a rat model of acute hepatic necrosis[J]. Am J Med Sci, 2011, 342(3):212-217.

4 杨晓凤, 张素芬, 郭子宽, 等. 干细胞应用新技术[M] . 北京: 军事医学科学出版社, 2010: 277-280.

5 杨彦林, 王树平, 王丽华, 等. 脐带血干细胞移植治疗非肝炎后肝硬化的临床研究[J]. 天津医药, 2013, 41(1):67-68.

6 Terada N, Hamazaki T, Oka M. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion[J]. Nature, 2002, 416(6880):542-545 .

7 杨宏丽, 于发涛, 李桂杰, 等. 脐血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化86例疗效观察[J]. 山东医药, 2010, 50(45):16-17.

8 陈海鸥, 胡小宣, 刘洪娟, 等. 脐血干细胞移植治疗肝硬化的疗效观察[J]. 中华肝脏病杂志, 2010, 18(7):537-538.

9 Piscaglia AC, Zocco MA, Di Campli C, et al. How does human stem cell therapy influence gene expression after liver injury? Microarray evaluation on a rat model[J]. Dig Liver Dis, 2005, 37(12):952-963.

10 邵珺, 何长伦, 盛云峰, 等. 脐带血干细胞移植治疗肝硬化患者术后并发自发性肾周围出血1例[J]. 实用肝脏病杂志, 2012, 15(5):462.

Effect of umbilical cord blood stem cells for the treatment of decompensated cirrhosis in patients with chronic hepatitis B

Wang Lihua1, Chen Yumei1, Li Bingmao2, Sun Jianshun1, Ya Bin1,Zhang Lixian1.1Department of Gastroenterology,2Department of Traditional Chinese Medicine, Harrison International Peace Hospital, Hengshui 053000, China

Objective To evaluate the clinical efficacy of umbilical cord blood stem cell therapy on decompensated cirrhosis in patients with chronic hepatitis B. Methods 60 chronic hepatitis B patients with decompensated cirrhosis were enrolled. The umbilical cord blood stem cells[（2 ~ 6）×107] were injected into liver by hepatic artery. To evaluate the clinical efficacy, albumin, total bilirubin, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and prothrombin activity after 1,4,12,20 weeks were observed. Serum Fibrosis Indexes (laminin LN, Hyaluronic acid HA, Ⅲprocollagen PC-Ⅲ and Ⅳ collagen Ⅳ-C) after 20 weeks and clinical symptoms were evaluated. Results No patients reported severe postoperative complications and adverse reactions. The spirit, strength and appetite of most patients returned to normal at 12 week. Edema and ascites disappeared. After one week of treatment, ALT, AST increased and serum albumin levels decreased ( P < 0.05), while TBIL slightly increased and PTA slightly decreased ( P > 0. 05). ALT, AST, ALB, PTA and TBIL returned to the levels of pretreatment, after four weeks of treatment. After twelve weeks of

Umbilical cord blood stem cell； Cirrhosis； Hepatitis B，chronic

2016-08-05）

（本文编辑：陈媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.005

河北省中医药管理局科研基金项目（2012234）

053000 衡水，哈励逊国际和平医院消化内科1，中医科2

陈玉梅，Email：cym031900@163.com

treatment, ALT, AST decreased( P < 0.05), Serum albumin levels improved greatly（P < 0.01）, and PTA increased too( P < 0. 05), while TBIL slightly decreased(P > 0.05). All serum biochemical index improved at twenty weeks after treatment,（P < 0.05）. Conclusion Umbilical cord blood stem cells are safe and effective for decompensated cirrhosis in patients with chronic hepatitis B.

王丽华，陈玉梅，李炳茂，等. 脐带血干细胞对慢乙肝失代偿期肝硬化的临床疗效[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版, 2016, 6(5):292-296.