猪腹膜脱细胞基质联合微骨折技术修复兔膝关节软骨缺损

孟庆阳 胡晓青 黄洪杰 刘振龙 敖英芳

北京大学第三医院运动医学研究所（北京 100191）

猪腹膜脱细胞基质联合微骨折技术修复兔膝关节软骨缺损

孟庆阳 胡晓青 黄洪杰 刘振龙 敖英芳

北京大学第三医院运动医学研究所（北京 100191）

目的：检测猪腹膜脱细胞基质（pig peritoneum-derived acellular matrix，PPAM）支架材料联合微骨折修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法：采用CCK-8 Kit测定SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）在PPAM支架上的生长状态，Live/Dead染色观察细胞在PPAM支架上的活性。用直径4mm环钻造成深度约1.5 mm的新西兰大白兔膝关节软骨缺损，微骨折术后将PPAM支架植入软骨缺损处，单纯微骨折技术（Microfracture，MF）作为对照组，分别在第6周、12周和24周取材。大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色和II型胶原（COL II）免疫组化染色检测软骨缺损修复的效果。结果：CCK-8 Kit和Live/Dead染色结果显示PPAM支架支持细胞生长和增殖，无细胞毒性。大体观察和组织学检测显示PPAM联合MF修复软骨缺损能促进软骨缺损填充组织的质量，组织学评分优于单纯MF组。结论：PPAM支架是一种有良好生物相容性的天然材料来源组织工程材料，联合MF技术能促进关节软骨缺损的修复。

软骨修复；脱细胞基质；微骨折；组织工程

由于缺乏足够的营养和前体细胞，关节软骨一旦损伤极难修复[1]。目前关节软骨损伤修复方法主要是微骨折/钻孔法、“马赛克”法软骨移植、自体软骨细胞移植、组织工程技术等。微骨折法操作简单，适合关节镜下进行，是临床修复软骨损伤的一线治疗方法。但研究表明，微骨折法修复软骨缺损的填充组织主要成分是纤维软骨，力学特性较差，表面粗糙不平，并且远期发生降解碎裂[2]。因此，在微骨折技术的基础上，辅助组织

工程支架植入，能有效提高软骨缺损处填充组织的质量，是一种较为有效的软骨修复方法[3]。

天然组织经脱脂、脱细胞处理后形成的脱细胞基质，其孔隙结构更适合细胞贴附、生长和增殖，分泌较多的细胞外基质[4]。此外，良好的生物相容性和无毒性代谢产物，都使得脱细胞基质材料在组织工程修复软骨缺损中具备优势[5]。本研究采用猪腹膜来源的脱细胞基质材料，联合微骨折技术，来探讨修复软骨缺损的效果。

1 材料与方法

1.1猪腹膜脱细胞基质

本支架材料由陕西佰傲再生医学有限公司提供（商品名：诱导软骨再生膜；型号：GCRM-4030），大小为4 cm×3 cm，厚度约300～500 μm。来源于猪腹膜组织片，经脱细胞、脱脂处理后射线灭菌。使用前将支架制成直径4 mm大小的PPAM片，分装后钴60照射灭菌贮存备用。

1.2BMMSCs细胞培养和PPAM生物相容性检测

6周龄SD大鼠乙醚麻醉后脱颈处死，75%酒精中浸泡10 min消毒。然后在超净台下无菌切开后肢皮肤，仔细剔除股骨周围的肌肉、筋膜等组织，离断股骨后用无菌PBS反复冲洗骨髓腔。将骨髓腔冲洗液转移至15 ml离心管中960转/分离心4 min，弃上清后加入α-MEM培养基重新混悬，然后接种在10 cm培养皿中，37℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。弃去旧培养基，PBS轻柔冲洗后加入新培养基，继续培养。镜下观察原代BMMSCs细胞达到80%融合率后传代。本实验所用BMMSCs为三代细胞（P3）。

取12孔板，每孔底部平铺无菌的不粘附性Parafilim膜，将直径4 mm的PPAM置入。将P3 BMMSCs混悬后调整成106/ml的细胞悬液，取100 μl滴加到PPAM上，37℃、5%CO2孵箱中孵育30 min，然后每孔补充2 ml α-MEM培养基继续培养。分别在1、3、5和7天时取出支架，PBS冲洗2次后加入CCK-8 Kit工作液孵育1 h，在多功能酶标仪中测定OD值。

按上述同样操作接种细胞，72 h后取出PPAM支架，PBS冲洗2次。将Live/Dead试剂A加入到试剂B中配成工作液，每支架加入100 μl Live/Dead工作液，室温下避光孵育30 min，然后PBS冲洗2次，置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.3手术过程

选择3月龄成年雄性新西兰大白兔，体重约2.5～3 kg。按照1.5 ml/kg的剂量耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠诱导麻醉，0.2 ml/kg的剂量肌肉注射陆眠宁/氯胺酮混合液（体积比为1：1）维持麻醉状态。常规脱毛备皮，膝关节内侧入路依次切开皮肤、皮下组织、关节囊，将髌骨推向外侧脱位并屈膝保持，充分暴露股骨滑车。用直径4 mm的角膜环钻在股骨滑车区关节面上钻取深约2 mm的软骨缺损，深度以不钻透软骨下骨为宜，取出软骨块，修整软骨缺损基底，用2 ml注射器针头刺透软骨下骨，见骨髓腔中血液渗出。将PPAM支架填塞进缺损内，用双腔推液器注射纤维蛋白胶（倍绣胶）A工作液和B工作液，5 min后可见纤维蛋白胶形成，支架固定于软骨缺损处。复位关节，逐层缝合关节腔。术后三天内肌注头孢唑林钠0.2 g/kg，自由笼养12周、24后取材。

图1 手术过程

1.4关节软骨修复效果评估

1.4.1兔膝关节大体标本获取及处理

兔2%戊巴比妥钠过量麻醉处死，逐层打开膝关节皮肤、皮下组织、关节囊，离断兔膝关节股骨端，剔除周围肌肉、韧带等软组织。PBS冲洗标本5 min，观察图膝关节软骨缺损修复情况并拍照记录。大体观察完成后将标本置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，然后置于快速脱钙液中脱钙72 h。修整标本，将含有软骨缺损的区域取出，置于包埋盒中流水冲洗3 h，70%酒精中浸泡30 min。自动脱水机中脱水过夜，常规石蜡包埋。

1.4.2组织学染色

1.4.2.1HE染色

石蜡包埋标本常规切片、展片、捞片、烤片，将切片在自动染片机中进行HE染色，中性树脂封片后通风橱中风干，采集图像。

1.4.2.2甲苯胺蓝染色

将切片在自动染片机中脱蜡至水，甲苯胺蓝染色8 min，自来水洗去浮色，95%酒精中脱水2 s，100%酒精中脱水2 s，二甲苯替代物溶液中透明1 min，中性树脂封片后通风橱中风干，采集图像。

1.4.2.3免疫组化染色

将切片在自动染片机中脱蜡至水，3%H2O2去离子水15 min，PBS冲洗3次每次3 min；胃蛋白酶抗原修复30 min，37°C避光孵育，PBS冲洗3次每次3 min；小鼠抗兔COL II或COL I抗体4°C过夜；PBS冲洗3 min，3次；二抗37°C孵育30 min；PBS冲洗3 min，3次；DAB显色；流水冲洗3 min；苏木精复染细胞核5 min，自来水洗去浮色，分色2 s，返蓝2 s，95%酒精中脱水2 s；100%酒精中脱水2 s；二甲苯替代物溶液中透明1 min，2次；中性树脂封片后通风橱中风干，采集图像。

1.4.2.4组织学评分

根据软骨修复的组织学评分系统对组织学染色进行评分。

1.5统计学方法

采用SPSS 20统计软件进行标准误、单因素方差分析统计学分析，数据以（均数±标准差）表示，当P值小于0.05时，差异具有显著性。

2 结果

2.1生物相容性

2.1.1CCK-8 Kit

从图2可看出，随着培养时间的延长，OD值逐渐升高，亦即细胞量逐渐增多，说明PPAM支持细胞生长和增殖，无明显细胞毒性。在细胞接种第5天时，OD值明显高于第1天和第3天，但与第7天无明显差异，可能与支架上细胞增殖到一定数量，生长空间有限有关。

图2 CCK-8 Kit测定不同时间点的OD值

2.1.2Live/Dead染色

从Live/Dead染色图像中可以看到，BMMSCs细胞保持长梭形，代表活细胞的绿色多，而代表死细胞的红色较少，说明PPAM能支持细胞保持相应表型，对细胞活性无影响，无细胞毒性。

图3 Live/Dead染色激光共聚焦图像

2.2软骨修复效果

2.2.1大体观察

在术后6周，微骨折组软骨缺损处基本无填充，凹陷明显，与周围正常软骨有明显界限；PPAM组软骨缺损处填充也不完全，但较微骨折组填充程度多。术后12周时，两组软骨缺损填充均明显增多，基本与周围正常软骨达到同一高度。但微骨折组填充组织内部有较大不融合缺口。术后24周，两组软骨缺损进一步填充，表面基本与正常软骨齐平，但微骨折组呈现明显的白色纤维软骨样，PPAM组则较为透亮。

图4 术后6、12和24周时软骨缺损修复情况大体观

2.2.2 组织学染色

术后6周时，HE染色显示微骨折组基本无填充，缺损底部可见血凝块残留，可见少量纤维状组织，细胞量极少；PPAM组有部分填充，但缺损处和正常软骨仍有差距，组织细胞较多，结构较密。甲苯胺蓝染色显示微骨折组填充组织基本呈阴性染色，说明分泌的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）较少；PPAM组修复组织着色较浅，但较微骨折组染色深，说明此时有少量ECM分泌。COL II免疫组化染色也和甲苯胺蓝染色结果相一致，两组着色均较浅，说明6周时还未合成较多的II型胶原。COL I免疫组化染色显示微骨折组着色较浅，基本无COL I的分泌，而由于支架成分是I型胶原的缘故，PPAM组着色稍深。

术后12周时，HE染色显示微骨折组填充增多，但仍为纤维状组织，细胞量少，结构疏松；PPAM组填充也增多，结构较为致密，细胞量较多。甲苯胺蓝染色显示微骨折组填充组织基本呈阴性染色，说明分泌的ECM仍较少；PPAM组修复组织着色变浅，但与正常软骨仍有明显差别，说明此时软骨ECM分泌仍不多。COL II免疫组化染色显示微骨折组着色较浅，PPAM组着色加深，说明II型胶原合成明显增多。COL I染色结果显示，微骨折组和PPAM组均有I型胶原的合成，PPAM组着色稍深。

术后24周时，HE染色显示微骨折组填充高度已达正常软骨，但呈纤维软骨样，结构疏松，与正常软骨融合不佳，且组织内部出现裂隙；PPAM组填充接近正常软骨，结构较为致密，细胞量较多，与正常软骨之间可见交界线，但融合性好。甲苯胺蓝染色显示微骨折组填充组织底部呈阳性染色，上层组织染色较浅，说明修复组织内底部含较多的软骨ECM，但上层组织缺乏；PPAM组修复组织着色较深，已基本接近正常软骨，说明此时PPAM组软骨ECM分泌接近正常软骨。COL II免疫组化染色显示微骨折组着色较浅，PPAM组着色较深，说明微骨折组修复组织的II型胶原合成较少，而PPAM组合成较多。COL I染色结果显示，微骨折组和PPAM组均有I型胶原的合成，微骨折组可见局部深染，证实了I型胶原成分为主，而PPAM组的着色和周围正常软骨的着色已基本接近。

图5 术后6、12和24周时软骨缺损修复的HE染色

图6 术后6、12和24周时软骨缺损修复的甲苯胺蓝染色

图7 术后6、12和24周时软骨缺损修复的COL II免疫组化染色

图8 术后6、12和24周时软骨缺损修复的COL I免疫组化染色

3 讨论

由于关节软骨缺乏足够的营养和前体细胞，一旦损伤，很难靠自身修复[6]。未深达软骨下骨板的软骨缺损，无修复能力，经长期磨损后会造成周围正常软骨的退变，进而产生关节疼痛和关节障碍。深达软骨下骨板的软骨缺损，可以产生修复组织，但主要成分是纤维软骨，其生物力学性能远不如正常软骨[7]。尽管微骨折手术可以在一定程度上缓解关节疼痛和填充缺损，但远期疗效并不理想。因此，利用生物材料联合微骨折技术，提高修复组织的透明软骨含量，是目前治疗的重要策略。

本研究采用的猪腹膜脱细胞基质支架，具有特殊结构：致密层和疏松层。致密层可以截留细胞，疏松层杂乱排列的胶原纤维，一方面利于截留细胞，另一方面有利于细胞贴附。从激光共聚焦图像（图3）中可以看出，细胞沿胶原纤维束贴附生长，细胞活性好，说明支架材料具有良好的生物相容性。在动物实验中，也发现PPAM组组织填充的细胞量较多，组织结构更为致密（图5、6、7）。CCK-8 Kit的结果显示，随培养时间延长，支架上的细胞量逐渐增多，说明细胞在支架上增殖良好（图2）。

良好的生物降解性、无毒性代谢产物是组织修复成功的重要影响因素。在本实验中，6周时的组织学染色结果表明，此时的PPAM支架已完全降解，说明支架具有良好的生物降解性。同时，修复组织内未见明显的嗜酸粒细胞浸润，说明其代谢产物无明显毒性，不会引起明显的炎性反应。

猪腹膜组织经脱脂、脱细胞处理后，残留的结构内含有生物因子等ECM成分，将有益于促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。采用微骨折联合猪腹膜脱细胞基质进行软骨修复，具有以下明显优势：（1）支架的特殊结构有利于骨髓间充质干细胞的存留和贴附，从而有利于细胞增殖和ECM分泌；（2）脱细胞基质内的生物因子，有利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化；（3）本方法一次完成，方便快捷，有临床应用的优势。

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Application of Combined Pig Peritoneum-derived Acellular Matrix and Microfracture Technique for Repairing Articular Cartilage Defect in Rabbit

Meng Qingyang，Hu Xiaoqing，Huang Hongjie，Liu Zhenlong，Ao Yingfang
Institution of Sports Medicine，the Third Affiliated Hospital of Peking University，Beijing，China 100191 Corresponding Author：Ao Yingfang，Email：aoyingfang@163.com

Objective To evaluate the outcome of articular cartilage repair using pig peritoneum-derived acellular peritoneum matrix（PPAM）in combination with microfracture（MF）technique in rabbit.Methods The growth of bone marrow-derived mesenchymal stem cells（BMMSCs）and the activity of BMMSCs on the PPAM was respectively observed by CCK-8 Kit and Live/Dead staining.The cartilage defect（4mm in diameter and 1.5mm in depth）in knee trochlea of rabbit was made by a trephine.A part of the defects was implanted with PPAM in treatment group，and the remaining defects were served as MF group.Gross observation，HE staining，toluidineblue staining and immunohistochemical staining of collagen type II were used to evaluate the outcome of articular cartilage repair at 6，12 and 24 weeks after the operation.Results The PPAM supported the growth and proliferation of BMMSCs well enough without any cytotoxicity.The histological score in treatment group was significantly higher than in the MF group.Conclusions The combination of PPAM and microfracture technique was beneficial for articular cartilage repair due to its good biocompatibility.

cartilage repair，acellular matrix，microfracture，tissue engineering

2016.05.03

国家自然科学基金重点项目（81330040）

敖英芳，Email：aoyingfang@163.com