液相色谱-串联质谱直接进样法测定人尿中的沙丁胺醇

申利景晶于瑷旗张力思徐友宣董颖何根业

1国家体育总局反兴奋剂中心（北京 100029）2北京体育大学（北京100084）

液相色谱-串联质谱直接进样法测定人尿中的沙丁胺醇

申利1景晶1于瑷旗2张力思1徐友宣1董颖1何根业1

1国家体育总局反兴奋剂中心（北京 100029）2北京体育大学（北京100084）

沙丁胺醇（salbutamol）为世界反兴奋剂机构（WADA）颁布的《禁用清单》中的阈值物质，兴奋剂检测工作需要对其进行定量测定。尿样加入内标后用5%醋酸铅溶液沉淀蛋白并稀释尿样，无需其它前处理步骤，直接进样于高效液相-串联质谱仪（HPLC-MS/MS）进行分析，使用ZORBAX SB-aq柱进行分离，使用多反应监测（MRM）模式进行测定，建立了阈值物质沙丁胺醇的定量检测方法并进行了方法验证。尿中定量限为0.02 μg/ml，线性范围（r2＞0.99）为0.02～10 μg/ml，实验的日内精密度和日间精密度（CV）分别为2.67%和3.02%，测量不确定度为5.36%。阈值浓度时的定量偏差均小于10%。尿样无需水解和提取，操作简单，结果准确。该方法可应用于常规检测和WADA外部质量评估计划。

沙丁胺醇；禁用清单；阈值物质；液相色谱-串联质谱；多反应监测；直接进样

沙丁胺醇（salbutamol）属于β2激动剂，是临床上应用很广泛的药物，主要用于治疗和预防哮喘发作，近年来有研究发现伴随其支气管扩张作用的同时，大剂量的使用此药具有促进蛋白合成、脂肪分解的蛋白同化作用[1-4]，因而WADA将其列入禁用清单中。由于有些运动员确实需要治疗哮喘，因而WADA规定允许运动员用于治疗目的吸入沙丁胺醇（最大吸入量1600 mg/ 24 hr），而口服沙丁胺醇则构成违规[5]。文献表明口服或吸入给药后，24%～33%的沙丁胺醇以原型形式经尿排泄，48%左右以硫酸酯形式在尿中存在[6,7]。WADA技术文件规定沙丁胺醇为阈值物质，尿中阈值为1.0 μg/ml。明确规定实验室只须对游离和葡萄糖醛酸结合的沙丁胺醇进行定量，超过阈值检测限浓度1.2 μg/ml时报告阳性结果[8]。2004年奥运会期间雅典兴奋剂检测实验室的检测认为尿中葡萄糖醛酸结合的沙丁胺醇在兴奋剂检测工作中可以忽略不计[9]。提示作为兴奋剂检测定

量方法，直接测定游离沙丁胺醇浓度即可达到WADA技术文件要求。现阶段，北京兴奋剂检测实验室采用酶解后液液萃取，TMS衍生化后进行GC-MS分析的方法进行定量，工作中存在前处理步骤繁琐、分析时间较长、结果重现性较差、回收率较低（＜40%）、不确定度较高等问题。

近年来随着液相色谱-质谱仪灵敏度的增高，越来越多的研究工作采用直接稀释进样的方法检测不同基质中包括禁用物质在内的各类化合物[9-13]，但多采用水稀释样品并使用我实验室不具备的UPLC-MS/MS方法，不适用于我实验室现有仪器设备。工作中我们使用文献中直接用水稀释尿样的方法进样于实验室现有仪器（Agilent 6410 Triple Quad），发现定量结果标准偏差较大，结果重现性不好，不能满足WADA技术文件的要求。我实验室在刺激剂类禁用物质定性检测中使用醋酸铅沉淀尿中蛋白直接稀释进样方法，目前已进行了约万例尿样的常规检测，效果良好，且未发现对质谱造成不良影响。本工作拟通过醋酸铅沉淀法对尿样进行简单的前处理，利用实验室现有仪器开发人尿中沙丁胺醇的HPLC-MS/MS定量检测方法并应用于兴奋剂检测实验室的日常工作中，保证实验操作简单易行，结果准确可靠。

1 试验部分

1.1仪器设备

6410 Triple Quad液相色谱质谱仪：美国Agilent公司；色谱柱：ZORBAX SB-aq，3.5 μm×2.1 mm×150 mm美国Agilent公司；电子天平：瑞士Mettler Toledo公司；Dri-block DB-3D氮气吹干装置：美国Techne公司；低速离心机：美国Thermo公司；低温恒温液浴循环两用槽：杭州雪中炭恒温技术有限公司；超纯水机：美国Millipore公司；振荡器：德国Gmbh&Co.KG公司；Finnpipette系列取液器：美国Thermo-Finnpipette公司。

1.2试剂与材料

沙丁胺醇（salbutamol）标准品：中国药品生物制品检定所。沙丁胺醇气雾剂：葛兰素史克制药（重庆）有限公司；硫酸沙丁胺醇片剂：石家庄康力药业有限公司；沙丁胺醇D3（salbutamol D3，内标，100 ng/μL丙酮溶液）：Dr.Ehrenstofer GmbH.德国；乙腈、甲醇、甲酸胺、甲酸（色谱纯）：DIKMA TECHNOLOGY Inc.美国；β-Glucuranidase from Escherichia Coli：SIGMA ALDRICH .美国；醋酸铅（PbAc2）：国产分析纯试剂。沙丁胺醇阳性尿：WADA提供及实验室2013年组织受试。

1.3试剂，标准溶液、控制尿样的配制及阳性尿的采集

5%醋酸铅溶液：5 g分析纯醋酸铅溶于100 ml水。准确称取沙丁胺醇标准品1.0 mg，加入1.0 ml甲醇配制成1.0 mg/ml的标准储备溶液，再倍比稀释成10 ng/μL的标准溶液备用。配制两份平行的标准储备溶液用于方法验证。

准确量取1.0 ml沙丁胺醇D3标准品溶液，加入9. 0 ml甲醇配制成10 ng/μl的内标溶液备用。

取不同量的沙丁胺醇标准溶液，吹干，加入空白尿溶解即为控制尿样。

阳性尿：阳性尿1：WADA提供的受试样品，阳性尿2：成年男性（体重65 kg）一次性吸入沙丁胺醇气雾剂0.2 mg后按时间段留取尿样；阳性尿3：同一志愿者每天吸入沙丁胺醇气雾剂0.2 mg，连续7天后按时间段（最后一次给药为0 h）留取尿样。阳性尿4：同一志愿者一次性口服沙丁胺醇片剂2片（含沙丁胺醇4.0 mg）后按时间段留取的尿样。

1.4实验方法

1.4.1前处理方法

尿样0.5 ml，加50 μl内标溶液（沙丁胺醇D3，10 ng/μl），加入0.5 ml 5%的醋酸铅溶液，涡旋振荡30秒后3000 rpm下离心5分钟，取上清液400 μl入进样瓶，进行HPLC-MS/MS分析。

1.4.2色谱条件

采用ZORBAX SB-aq，3.5 μm×2.1 mm×150 mm液相色谱柱；柱温40℃；流动相采用pH 3.5的甲酸铵缓冲液（A）和乙腈（B）进行梯度洗脱；洗脱梯度：0～3 min：95%A～5%B，3～5 min：0%A～100%B；5～10 min：0%A～100%B。流速0.3 ml/min，运行10 min，平衡6 min；进样量10 μl。

1.4.3质谱条件

多反应离子监测（MRM）；离子化方式：电喷雾（ESI）；离子极性：正离子模式；毛细管电压：4000 V；干燥器温度：330℃；干燥器流速：10.0 L/min；采用240. 4→148.2，240.4→166.2，240.4→240.4为定性分析离子对（图1）。定量分析采用离子对240.4→166.2（沙丁胺醇）和243.5→169.3（沙丁胺醇D3）进行比较，锥孔电压均为100V，碰撞电压分别为10 V和17 V。其MRM离子流图见图2。

图1 沙丁胺醇阳性尿（上）和空白尿（下）定性MRM离子流图

2 结果与讨论

2.1分析条件的选择

根据药物的结构特征，选择正离子模式。通过分别优化锥孔电压和碰撞电压产生碎片进行二级质谱扫描，选择丰度较高且无干扰的离子对240.4→166.2（沙丁胺醇）和243.5→169.3（沙丁胺醇D3）作为定量检测离子。

沙丁胺醇分子极性大，在样品初筛使用ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱进行分析时保留时间短，色谱峰拖尾，对称性不好。实验中比较了Agilent ZORBAX SB-C18，ZORBAX Eclipse XDB C18，ZORBAX Eclipse XDB CN，Pursuit PFP，Agilent Zorbax SB-aq等液相色谱柱，经过实验比较，综合了保留时间、响应信号和峰形对称性等多种因素，选择了Agilent Zorbax SB-aq，3. 5 μm×2.1 mm×150 mm色谱柱，以乙腈/水作为流动相体系，在流动相中添加缓冲盐调节系统的pH值。通过不同的洗脱梯度比较，确定了乙腈的起始浓度为5%、最终浓度为100%、运行时间为10 min的梯度洗脱条件，能得到较好的分析结果。由图2可见，沙丁胺醇和沙丁胺醇D3的MRM谱图离子响应良好，峰形对称，在保留时间段无干扰。

2.2尿样前处理方法的选择

科隆实验室研究表明口服沙丁胺醇后尿中存在大约3%的葡萄糖醛酸结合物[13]。为了比较酶水解对定量结果的影响，首先需要研究酶水解的效率以确定适合的水解条件。由于我实验室没有沙丁胺醇葡萄糖醛酸结合标准品，因而使用口服后8小时的受试尿样进行实验。各取尿样0.5 ml，3份为1组，共4组，同时取校准曲线控制尿样（0.3，0.6，1.2，2.0，3.0 μg/ml）各0.5 ml，加0.5 ml水，加50 μl内标（沙丁胺醇D3，10 ng/μl）甲醇溶液，加入1 ml磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L NaH2PO4水溶液，pH=6.8）及50 μl β-Glucuranidase（约2500 Units），每组分别在55℃水浴中水解1小时，2小时，4小时及过夜（约24小时）。冷却后加入1g碳酸盐固体缓冲剂（NaHCO3：K2CO3=3：2，w/ w，pH=9.5）和3ml提取液（乙醚/异丙醇=9/1，v/v）萃取，留取有机相于60℃氮气流下吹干，用初始流动相溶解定容至500 μL，进行HPLC-MS-MS分析。尿中沙丁胺醇测定值分别为1.868±0.121、1.853±0.116、1.874± 0.133、1.866±0.150 μg/ml。说明55℃水解1小时即可视为完全水解。同样取一次性吸入后1.0、3.3、5.0、9.0小时尿样，连续7天吸入后1、2.5、5.5、9.0小时尿样，口服后1.7、3.5、8.0、22.0小时尿样各3份和校准曲线样品经上述方法酶水解2小时后进行提取检测，再取另一份同样的样品加入内标后不经过水解，加入碳酸盐固体缓冲剂和提取液萃取后吹干、定容，进样10 μl于HPLC-MS/MS。酶水解后液液萃取和直接液液萃取后的定量结果见表1。

表1 水解后提取、直接提取与直接稀释进样的定量结果

吸入给药的部分数值可能已超出方法的线性范围，但测定浓度远远低于阈值，不会对兴奋剂违规造成影响。强制过原点绘制校准曲线后计算同一尿样的测定值，是否水解的测定值未见显著性差异，与文献[9]描述相符，尿液中沙丁胺醇的葡萄糖醛酸结合物含量与游离形式相比可以忽略不计。在阈值浓度时上述液液萃取方法的回收率约为40%，工作曲线和定量结果令人满意，但需要较多的前处理步骤，耗时耗力。

本实验还比较了液液萃取和直接稀释进样结果。有研究表明使用水稀释样品直接进样的LC-MS方法进行麻黄碱类禁用物质定量检测时误差较大，原因可能为尿中蛋白类等物质的干扰[15]。因此，本研究采用直接稀释进样法比较了使用初始流动相（甲酸铵缓冲液/乙腈=95/5，v/v）2倍稀释、10倍稀释，使用纯水2倍稀释、10倍稀释以及使用5%醋酸铅溶液2倍稀释、10倍稀释后的定量结果，所有稀释方法的校准曲线均可达到0.99以上的相关系数，但在测定不同人的尿样配置的质量控制样品和WADA外部质量评估计划样品（靶值为1.482 μg/ml）时得到不同的定量结果，见表2。综合工作曲线的相关系数、目标化合物质谱响应丰度及基质干扰、质控样品及WADA外部质量评估计划样品测定的准确度及精密度等情况，确定了尿样直接加入等量5%醋酸铅溶液（相当于2倍稀释）的方法为最终定量检测方法。采用此方法分析不同给药方式获得的阳性尿的定量结果见表1。3组数据相关性好，对同一尿样测定值的相对偏差均小于10%，实验结果表明在兴奋剂检测工作中可以无需水解步骤，直接检测其游离药物浓度即可满足WADA技术文件[8]要求。

表2 不同方法直接稀释进样的定量结果

3 方法验证

3.1定量限

配制较低浓度的沙丁胺醇控制尿样，依实验方法直接稀释后进行分析检测，选择240.4→166.2信噪比大于10∶1的最低浓度，得到尿中沙丁胺醇的定量限（LOQ）为0.02 μg/ml。

3.2线形

配制浓度分别为0.02、0.20、0.60、1.5、3.0、6.0、10 μg/ml的一系列控制尿样，依实验方法进行检测，以尿中待测物与内标的峰面积比值为横坐标、待测物的浓度为纵坐标作标准曲线。用最小二乘法进行线性回归分析（r2＞0.99），依WADA技术文件要求，强制过原点后绘制校准曲线，结果见图2，表明沙丁胺醇在0.02～10.0 μg/ml的浓度范围内具有良好的线性关系。

3.3阈值浓度时测定的准确度、精密度与回收率

选用浓度为1.0 μg/ml的沙丁胺醇10份，使用两份标准品储备溶液配制两条校准曲线尿样，与控制尿样一起同时加入内标依实验方法进行测定，通过定量离子峰面积比值得到实测值，其中一条校准曲线的定量结果分别为1.015、0.965、0.982、1.030、0.938、1.010、0.942、1.005、1.016、0.950 μg/ml，使用另一条校准曲线得到的结果为：1.022、0.972、0.989、1.030、0.944、1.017、0.948、1.012、1.023、0.957 μg/ml，相对偏差均小于10%。符合WADA技术文件的要求。

浓度为1.0 μg/ml控制尿样10份，同样依实验方法进行测定（同人，同设备），得到定量值分别为1.066、1.001、0.989、0.986、1.011、0.994、1.013、1.041、0.982、1.027 μg/ml，计算日内精密度为2.67%。

按照日内精密度的操作方法，每天操作1次，使用不同操作者、不同设备，共3次，测定值分别为1.066、1.001、0.989、0.986、1.011、0.994、1.013、1.041、0.982、1.027μg/ml（第1天），1.022、0.972、0.989、1.030、0.944、1.017、0.948、1.012、1.023、0.957 μg/ml（第2天），0.982、1.032、0.959、1.013、0.968、1.041、1.022、1.000、1.015、0.966 μg/ml（第3天），比较所有数据，计算得到日间精密度为3.02%。

根据浓度为1.0 μg/ml控制尿样3天共40份尿样的测定值，计算方法回收率为99.98%±3.09%。

按照WADA提供的不确定度计算公式[14]，得到在阈值浓度时沙丁胺醇测定的不确定度（Uc）为5.36%。

3.4稳定性

配制浓度为1.0 μg/ml的沙丁胺醇控制尿样和WADA提供的阳性尿（靶值浓度为1.482 μg/ml，实验室第1次定量结果为1.471±0.044 μg/ml）一起于－20℃和55℃水浴反复冻融3次后，分别取5份尿样与新配置的校准曲线尿样一起依前述方法进行分析，沙丁胺醇测量值为0.998±0.020 μg/ml和1.469±0.031 μg/ml（n=5）；尿样于4℃保存60天，同样得到测量值为0.989±0.014 μg/ml和1.473±0.028 μg/ml（n=5）。与第1次检测时的数值相比相对偏差均小于±2%。说明尿样冷冻保存反复解冻及在冷藏保存60天以内稳定性良好，未对测定结果的准确性产生不良影响。

4 结论

本研究利用我实验室现有的仪器设备，建立了直接进样于液相色谱-串联质谱测定WADA禁用物质沙丁胺醇的定量方法并进行了方法验证。整个实验过程无需水解和萃取步骤，更是免除了GC-MS方法必需的衍生化反应，最大限度地减少了样品的前处理步骤，大大降低了前处理过程中引入误差的可能，缩短了检测周期，降低了检测成本。定量结果的精密度得到了提高。实验结果表明，本方法重现性好，精确度高，无干扰，定量结果准确可靠，完全满足WADA技术文件的要求。配制的控制尿样可长期冷冻保存。

目前本方法已应用于我实验室WADA的外部质量评估计划中沙丁胺醇的定量检测，在两次WADA外部质量评估计划中，使用此方法与原有GC-MS方法及其他实验室的定量结果比较，数值相关性好，结果令人满意，完全可以达到WADA的技术文件要求。

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Dilute and shoot Method for the Quantification of Salbutamol in Human Urine through Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Shen Li1，Jing Jing1，Yu Aiqi2，Zhang Lisi1，Xu Youxuan1，Dong Ying1，He Genye1
1 China Anti Doping Agency，Beijing，China 100029 2 Beijing Sports University，Beijing，China 100084 Corresponding Author：Shen Li，Email：shenli@chinada.cn

Objective To introduce a dilute and shoot method for quantification and validation of salbutamol.Methods The urine samples were diluted with 5%lead acetate solution and then injected their supernatant into HPLC/MS/MS directly.Results After determination of the series of spiked urine samples，the LOQ，linear ranges（r2＞0.99），intra-and inter-day precisions（CV），and measurement uncertainty of salbutamol in urine were respectively 0.02 μg/mL，0.2～10.0 μg/mL，2.67%and 3.02%，and 5.36%.The analytical biases at threshold concentration were less than 10%.Conclusion This dilute and shoot quantitative method has been successfully applied to the routine analysis and the External Quality Assessment Scheme of WADA in our laboratory.

salbutamol，WADA，threshold substance，HPLC-MS/MS，lead acetate，dilute and shoot

2015.06.25

国家体育总局重点研究领域课题（2013B002）

申利，Email：shenli@chinada.cn