补脑软胶囊对血管性痴呆小鼠学习、记忆能力和海马组织的影响*

李喜香，潘从泽，王建良，李季文，毕映燕，张亚会，钱梦茹

(1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730020； 2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)



·实验研究·

补脑软胶囊对血管性痴呆小鼠学习、记忆能力和海马组织的影响*

李喜香1，潘从泽2，王建良2，李季文2，毕映燕2，张亚会2，钱梦茹2

(1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730020； 2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)

目的：观察补脑软胶囊对血管性痴呆小鼠模型的学习、记忆能力和海马组织的影响。方法：采用反复加闭双侧颈总动脉方法制备血管性痴呆小鼠模型。将造模成功的小鼠随机分为假手术组,模型对照组,补脑软胶囊高、中、低剂量组和尼莫地平组6组。给药第20天进行用跳台实验检测小鼠学习和记忆能力；给药第28天取小鼠海马组织进行HE染色，观测CA1区的组织病理学改变。结果：学习成绩方面，各给药组与模型对照组对比，学习反应时间均缩短，错误次数均减少，差别有统计学意义(P<0.01)；补脑软胶囊高剂量组与尼莫地平组对比，反应时间缩短，错误次数减少，差别有统计学意义(P<0.05)。记忆成绩方面，各给药组与模型对照组对比，潜伏期时间均延长，错误次数均减少，差别有统计学意义(P<0.05)；补脑软胶囊高剂量组与尼莫地平组对比，潜伏时间延长，错误次数减少，但差别无统计学意义(P>0.05)；补脑软胶囊高剂量组与低剂量组对比，错误次数减少，差别有统计学意义(P<0.05)。各给药组均可减轻海马组织CA1锥体细胞的损伤，补脑软胶囊高剂量组优于尼莫地平组。结论：补脑软胶囊能够改善血管性痴呆小鼠的学习、记忆能力，减轻海马组织损伤，对血管性痴呆小鼠有一定的治疗作用。

补脑软胶囊/药效学；跳台实验；学习记忆；海马病理；动物；小鼠

血管性痴呆(vasculardementia，VD) 是各种脑血管病变引起的获得性智能损害和认知障碍的综合征，是一种慢性进行性疾病，表现为记忆、计算、定向、判断能力下降，可伴有情感障碍、行为异常、认知功能障碍和相关脑血管病的神经功能障碍[1]。如何改善和提高VD患者的学习、记忆能力，已成为医药领域的研究热点之一。补脑膏(批准文号甘药制字Z04000828)是甘肃省中医院院内制剂。近30a的临床实践证实，其对脑外伤性神经损伤及后遗症，脑炎、脑膜炎后遗症，脊髓变性等脑部疾病疗效确切，同时对血管性痴呆的治疗和预防有明显的临床效果[3-4]。补脑软胶囊是在补脑膏原处方基础上，运用现代技术研制而成。本实验将补脑软胶囊内容物作用于血管性痴呆小鼠模型，探讨其疗效及部分作用机制，从而为补脑软胶囊的临床用药提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康SPF级KM小鼠，雄性，体质量22～25g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

补脑软胶囊由川芎、当归、黄芪、枸杞子、黄精、仙茅、淫羊藿等药物组成，将浸膏粉加入大豆油基质、润湿剂司盘-80、助悬剂蜂蜡、助流剂微粉硅胶，1g内容物含浸膏粉0.48g；尼莫地平片，四川科伦药业股份有限公司产品，批号B140901015；注射用硝普钠，湖南科伦制药有限公司产品，批号B14050503。水合氯醛，天津市大茂化学试剂厂产品，批号20141013；40g/L多聚甲醛，北京索莱宝科技有限公司产品，批号20141223。DT200小鼠跳台测试仪，成都泰盟科技有限公司产品；TEC-VEMJ2 全自动组织包埋机、VIP-5Jr-J2自动组织脱水机、IVS-410石蜡切片机，均为日本SakuraFinetekJapanCo.Ltd产品；Bio-Rad680多功能酶标仪，美国伯乐公司产品；OlympusCKS41倒置显微镜，日本奥林巴斯公司产品；SIGMA3-18K低温高速离心机，德国希格玛公司产品。

1.3 模型的建立与动物分组

60只小鼠按体质量随机分为假手术组(生理盐水10μL/g)、模型对照组(生理盐水10μL/g)、补脑软胶囊高剂量(800μg/g)组、补脑软胶囊中剂量(400μg/g)组、补脑软胶囊低剂量(200μg/g)组和尼莫地平组(尼莫地平14μg/g)6组，每组10只。术前12h禁食、不禁水；以水合氯醛(500μg/g)腹腔注射麻醉小鼠，仰卧固定于手术台上，常规消毒，颈部正中切口；分离双侧颈总动脉(CCA)；在夹闭双侧CCA之前，腹腔注射硝普钠(2.5μg/g)，随即用无创动脉夹夹闭双侧CCA10min；再通10min；再夹闭10min；再通后缝合切口，放回笼中保温饲养。假手术组仅分离双侧CCA，不夹闭双侧CCA，不注射硝普钠[5-6]。术中小鼠肛温保持在36.5～37.5 ℃之间。术后连续3d肌肉注射青霉素以预防感染。各组手术后第1天均以灌胃方式给药(按体质量10μL/g)，连续给药28d，1d1次。药物均精密称定，以灭菌后的生理盐水配置为混悬液。

1.4 检测指标

1.4.1 跳台实验

灌胃第20天进行跳台实验，将小鼠置于反射箱内适应5min后轻放于平台上，小鼠在平台的停留时间为潜伏期。小鼠从平台跳下、接触铜栅视为错误，将受到电刺激后跳回平台以躲避伤害性刺激视为正常反应。记录小鼠首次受到电刺激跳回平台所需时间(即反应时间)、跳下安全台次数(即错误次数)作为学习成绩。于训练后24h进行测验，记录第1次跳下平台的潜伏期、5min内的错误次数作为记忆成绩[7]。

1.4.2 组织病理学

灌胃第28天进行小鼠海马部位取材。用冰的生理盐水进行心脏灌注后，分离两侧小鼠海马组织，一侧海马组织以40g/L多聚甲醛进行固定，洗涤，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，贴片，烤片，二甲苯脱蜡及水化，HE染色，封片等，采用光学显微镜(200倍)观察海马组织的变化。每个标本连续切片5张，切片厚度4μm。正常海马组织形态为CA1区锥体细胞分4层排列，排列整齐，形态完整，层次分明；胞质均质染色，核大而圆，胞核无固缩；纤维结构清晰可辨，未有淋巴细胞浸润[8～9]。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组小鼠学习成绩和记忆成绩对比

学习成绩：与假手术组对比，模型对照组小鼠的反应时间延长，错误次数增加，差别有统计学意义(P<0.01)，表明小鼠的学习成绩下降。与模型对照组对比，各治疗组反应时间均缩短，错误次数均减少，差别有统计学意义(P<0.05)。补脑软胶囊高剂量组与尼莫地平组对比，反应时间缩短，错误次数减少，差别有统计学意义(P<0.05)；与中、低剂量组对比，反应时间均明显缩短，差别有统计学意义(P<0.05)。结果表明：各治疗组均能提高血管性痴呆小鼠跳台实验学习能力，且在改善反应时间方面补脑软胶囊呈量效关系。

记忆成绩：与假手术组对比，模型对照组小鼠的潜伏时间缩短，错误次数增加，差别有统计学意义(P<0.01)，表明记忆成绩下降。与模型对照组对比，各治疗组潜伏时间均延长，错误次数均减少，差别有统计学意义(P<0.01)。补脑软胶囊高剂量组与尼莫地平对照组对比，潜伏时间延长，错误次数减少，但差别无统计学意义(P>0.05)；与低剂量组对比，错误次数减少，差别有统计学意义(P<0.05)。结果表明：各治疗组均可提高血管性痴呆小鼠跳台记忆成绩，且在增加潜伏时间方面有量效关系的趋势。见表1。

组 别剂量/(μg·g-1)学习成绩(灌胃第20天)反应时间/s错误次数/次记忆成绩(灌胃第21天)反应时间/s错误次数/次假手术组15.06±5.04**2.50±1.20**165.88±18.06**2.70±1.44模型对照组53.94±11.577.60±2.5280.14±21.407.80±2.40补脑软胶囊高剂量组80024.42±5.40**##△**4.30±1.56**#△150.95±20.49**△△4.10±1.32*补脑软胶囊中剂量组40030.36±5.04**5.20±1.60*135.77±30.09**5.60±2.28补脑软胶囊低剂量组20035.21±7.97**6.30±1.36139.49±38.63**5.90±1.88尼莫地平组1433.11±8.77**5.70±1.50123.92±21.68**5.10±1.54*

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与补脑软胶囊低剂量组对比，#P<0.05，##P<0.01;与尼莫地平组对比，△P<0.05，△△P<0.01；与补脑软胶囊中剂量对比，＊＊P<0.01。

2.2 各组小鼠海马组织CA1区组织病理学改变

光镜下，假手术组海马CA1区锥体细胞分4层排列，排列整齐，形态完整，层次分明；胞质均质染色，核大而圆，胞核无固缩；纤维结构清晰可辨，未见淋巴细胞浸润。模型对照组海马CA1区锥体细胞数量明显减少，排列散乱，层次不清；局部可见淋巴细胞浸润；部分锥体细胞明显受损，胞浆内可见空泡形成，细胞核固缩，纤维结构零乱不清。各治疗组海马CA1区锥体细胞轻度损伤或者损伤不明显，未见锥体细胞数量明显减少；局部细胞排列紊乱，纤维结构略零乱、不清晰；局部锥体细胞可见胞浆空泡形成。其中补脑软胶囊高剂量组小鼠海马 CA1区有少量脱失的锥体细胞，少数细胞核固缩，锥体细胞纤维排列较为整齐；中、低剂量组小鼠海马 CA1区锥体细胞部分脱失，部分细胞核固缩为三角形或多角形；尼莫地平组海马CA1区锥体细胞损伤不明显，未见锥体细胞数量明显减少，局部细胞排列紊乱、纤维结构零乱、不清晰，局部少量锥体细胞可见胞浆空泡形成。结果表明：药物对海马组织细胞起到了保护作用，补脑软胶囊高剂量作用优于尼莫地平。见图1。

A.假手术组;B.模型对照组;C.补脑软胶囊高剂量组;D.补脑软胶囊中剂量组;E.补脑软胶囊低剂量组;F.尼莫地平组

3 讨 论

跳台实验通过记录实验小鼠到安全平台的时间和受到电击的次数来反映实验动物寻找安全平台的空间认知能力和学习记忆能力[8]。本研究结果表明：补脑软胶囊对VD小鼠的学习记忆有一定的改善作用，与模型对照组对比，高剂量组反应时间、潜伏时间、错误次数均有显著性差别，中、低剂量改善作用相对较弱，有明显的量效关系趋势，呈剂量依赖性。海马是与认知功能密切相关的重要脑区，是学习、记忆的高级中枢之一，直接参与信息的整合与贮存；是空间学习记忆能力的关键结构，损害海马则影响空间学习记忆；因此，选择海马作为研究学习、记忆能力的主要部位，有着极其重要的意义。脑组织中海马区对缺血、缺氧最为敏感，其中海马CA1区是海马中最易受损的区域。急、慢性脑血管病变后海马CA1区细胞明显受损，伴随记忆力明显下降。海马组织中神经元的存活数量直接影响神经元突触的可塑性效应，影响信息的整合、储存和传递。因此，急、慢性脑血管病变后脑组织缺血、缺氧导致海马CA1区锥体细胞迟发性坏死，神经元的大量凋亡丢失，可能是患者脑卒中后发生 VD 的病理学基础[9-11]。本实验结果显示：补脑软胶囊高、中、低剂量组和尼莫地平组海马CA1区锥体细胞轻度损伤或者损伤不明显，未见锥体细胞数量明显减少。结果表明：补脑软胶囊对VD有一定的改善作用。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2016)11-0067-04

R749.1+

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.11.28

李喜香(1968-)，女(汉族)，甘肃秦安人，主任中药师，硕士研究生导师，主要从事中药制剂工艺研究。

兰州市科技计划(2012-2-78)

2016-05-16；

2016-09-06