胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的构建及其对细胞行为的影响*

宋益哲，任 英，娄茹云，王秀丽，于炜婷，马小军

(1. 中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023；2. 大连医科大学 组胚教研室，辽宁 大连 116622； 3. 中国科学院大学，北京 100039)



胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的构建及其对细胞行为的影响*

宋益哲1,3，任 英1,3，娄茹云1,3，王秀丽2，于炜婷1，马小军1

(1. 中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023；2. 大连医科大学 组胚教研室，辽宁 大连 116622； 3. 中国科学院大学，北京 100039)

利用溶液共混法制备了胶原/海藻酸钠混合液，建立了制备胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的方法，并证实互穿网络凝胶中，胶原与海藻酸钙二者共存且相互独立，胶原结构保持完好。与传统海藻酸钙水凝胶相比，本文建立的胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面疏水性增强且凝胶结构更加疏松，更利于细胞粘附与物质传递。以人源成纤维细胞为模型，通过考察细胞在凝胶表面与凝胶内部的形态，进一步证实胶原分子在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的表面与内部均有分布。细胞迁移实验结果也表明该胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶不仅能有效保持细胞活性，且为细胞迁移行为的研究提供了一种新的研究模型。

海藻酸钠；胶原；互穿网络；理化性质；细胞行为

0 引 言

海藻酸钠是来自褐藻的一种天然多糖，由D-甘露糖醛酸(M单元)和L-古洛糖醛酸(G单元)通过1,4-糖苷键连接而成[1-2]。海藻酸钙凝胶不仅具有良好的力学性能以进行空间支撑或填充，还具有良好的生物相容性、低免疫原性，是目前常用的三维(3D)细胞培养支架[3]。然而，海藻酸钠的亲水性太强，细胞很难在海藻酸钙凝胶表面粘附和内部伸展，并且部分细胞如胰岛细胞[4]，原代肝细胞[5]和干细胞[6]等在海藻酸钙凝胶内部很难保持比较好的细胞活性和功能。胶原是动物体内含量最丰富的细胞外基质成分，其在组织、器官形成和细胞功能方面起到重要作用[7]，但是纯的胶原凝胶力学性能差，无法广泛使用。

互穿网络结构(interpenetrating polymer network, 简称IPN)技术是由两种或两种以上的聚合物通过网络相互贯穿缠结形成的一类独特的聚合物结构[8-9]。共混是制备互穿网络水凝胶的常用方法，同时也是改善高分子材料性能及细胞粘附和伸展行为的重要手段[10-11]。本文利用溶液共混法将胶原溶液与海藻酸钠溶液共混，采用分步互穿法制备胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶。先调节pH值和温度使胶原凝胶化，再通过Ca2+引入使海藻酸钠凝胶化，从而制备成胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶。

本文重点考察了胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的表面结构、亲疏水性和表面形貌及胶原的二级结构。与传统海藻酸钙凝胶网络相比，胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶呈现更疏水、更高孔径的物化性质。并以人源成纤维细胞为模型，研究细胞在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面和内部的粘附、伸展和迁移行为，证实本文建立的胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶可作为支架模型用于研究细胞的生物学行为。

1 实 验

1.1 实验材料

海藻酸钠：青岛晶岩生物科技开发有限公司，分子量(Mw)为430 kDa；胶原I型：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。人源成纤维(HSF)细胞：中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库。

1.2 实验方法

1.2.1 平板海藻酸钙及胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的制备

海藻酸钙凝胶(Alg)的制备：将300 μL浓度为1.5%(质量分数)海藻酸钠(NaAlg)溶液流延平铺于经铬酸洗液洗涤并干燥的圆形盖玻片(直径为3 cm)上，静置5 min后浸于1.1%(质量分数) CaCl2溶液中形成海藻酸钙凝胶。

胶原/海藻酸互穿网络水凝胶(Col/Alg)的制备：采用10×HG-DMEM溶液和1 mol/L NaOH溶液调节3.6 mg/mL胶原溶液的渗透压和pH值，置于冰上待用。将1.5%(质量分数)海藻酸钠和胶原溶液按照1∶2体积比进行混合后平铺于玻片上，将其置于37 ℃含5% CO2细胞培养箱中孵育2 h，使胶原凝胶化，再将其浸于1.1%(质量分数) CaCl2溶液中使其中海藻酸钠凝胶化，从而制备成胶原/海藻酸互穿网络水凝胶。

1.2.2 傅里叶红外光谱(FT-IR)

采用傅里叶光谱仪TENSOR27 (德国BRUKER公司) 进行测定：用傅里叶衰减全反射红外光谱模式对凝胶表面进行扫描，扫描波长范围为400～4 000 cm-1[12]。

1.2.3 接触角的测定

凝胶经30%，50%，70%，90%，95%和100%(质量分数)乙醇梯度脱水真空干燥后，采用接触角测量仪(德国KRUSS公司)表征凝胶(或凝胶膜)的亲疏水性。以蒸馏水为标准溶液测量凝胶的接触角。测量时所用的水滴体积为3.0 μL。滴注后10 s内测量。数据是在3个不同位置测量的平均值[13]。

1.2.4 圆二色光谱

称取一定量的胶原与(或)海藻酸钠溶解于1 mmol/L的醋酸钠缓冲液(pH值=4.0)中，制备终浓度分别为200 μg/mL胶原溶液和100 μg/mL海藻酸钠溶液混合液、200 μg/mL胶原溶液和100 μg/mL海藻酸钠溶液，于4 ℃环境中静置12 h。采用圆二色光谱仪MOS450(法国BioLogic)分别对上述3种样品在190～260 nm进行扫描[14]。

1.2.5 扫描电镜

凝胶经30%，50%，70%，90%，95%和100%(质量分数)乙醇梯度脱水后，采用CO2临界点干燥仪K850(英国Quorum公司)进行干燥。样品喷金后，采用用扫描电镜Supra 55 VP (德国 Zeiss公司)观察表面形貌[8]。

1.2.6 细胞粘附及伸展

将一定细胞密度的人源成纤维细胞(HSF)分别接种在凝胶内部及凝胶表面，观察细胞在凝胶内部或凝胶表面粘附及伸展情况。

1.2.7 细胞死活情况检测—live/dead染色

将染色工作液(2 μmol/L Calcein AM，4 μmol/L ED-1溶于0.9%NaCl溶液)加入到载有细胞的凝胶中，37 ℃孵育1 h。孵育后采用生理盐水清洗2次，于激光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况：活细胞由Calcein标记在485 nm波长下发出绿色荧光；死细胞由ED-1标记在530 nm下发出红色荧光。

1.2.8 细胞迁移

采用细胞探针DiO标记HSF细胞，再将荧光标记HSF细胞接种在凝胶表面，培养14 d后，采用激光共聚焦进行观察，层层扫描、三维重建后，观察细胞能否从凝胶表面迁移至凝胶内部[15-16]。

2 结果与讨论

2.1 Col/Alg凝胶结构分析

图1 干燥后Alg凝胶、Col凝胶和Col/Alg表面的红外光谱图

Fig 1 FT-IR spectra of the surface of dried Alg gels, Col gels and Col/Alg gels

2.2 胶原二级结构分析

通常，天然存在的胶原在190～260 nm波长范围存在两个峰：198 nm处的负峰和221 nm处的正峰。从图2可以看出，与海藻酸钠混合的胶原混合液及胶原溶液在198和221 nm处均有明显的吸收峰，表明在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶中，胶原仍然保持其天然的三股螺旋结构。

图2 Collagen和Col/Alg混合液的圆二色光谱

Fig 2 CD spectra of the collagen solution and Col/Alg solution

2.3 亲疏水性分析

采用躺滴法测量了干燥后Alg凝胶和Col/Alg凝胶表面的水接触角以分析其亲疏水性。由图3可知，与传统海藻酸钙凝胶相比，胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面接触角由(21.08±1.19)°降低至(10.55±0.95)°，接触角显著降低。结果表明，胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面的疏水性显著增强，较传统海藻酸钙凝胶更利于细胞粘附。

图3 不同凝胶或凝胶膜的水接触角

Fig 3 Water contact angles of Alg gels and Col/Alg solution

2.4 表面形貌分析

由于本文制备的海藻酸钙水凝胶和胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶都是高含水量的水凝胶(含水量高达90%以上)，因此传统的真空干燥方法将极大破坏凝胶结构，导致SEM观测的表面形貌严重失真。为了最大程度保持凝胶表面形貌，本文采用CO2超临界流体干燥法干燥水凝胶。图4可以看出，Alg凝胶和Col/Alg混合凝胶表面均高度多孔，且多为贯穿孔。与海藻酸钙凝胶相比，胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶结构更为疏松，凝胶孔径更大，因此，更利于营养物质在凝胶网络的传递，利于保持细胞活性。

2.5 细胞在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的粘附及伸展研究

以人源成纤维HSF细胞为模型细胞，考察了HSF细胞在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面及内部的形态学。图5为HSF在Col/Alg凝胶和Alg凝胶表面粘附及在Col/Alg凝胶和Alg凝胶内部伸展情况。

图4 Col/Alg混合凝胶和Alg凝胶表面SEM形貌图

Fig 4 Scanning electron micrograph of Col/Alg and Alg hydrogels

图5 HSF在Col/Alg凝胶和Alg凝胶表面粘附及在Col/Alg凝胶和Alg凝胶内部伸展情况

Fig 5 Cell adhesion on the surface of Col/Alg and Alg hydrogels and cell spread in the Col/Alg and Alg hydrogels

从图5可以看出，HSF细胞可以粘附在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面，而不能粘附在海藻酸钙水凝胶表面；HSF细胞在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶内部伸展，而在单独海藻酸钙水凝胶内部呈球形不伸展。上述结果均提示，在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的表面和内部均有胶原分子分布，细胞在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的表面和内部均能保持良好的伸展形态；同时，图6(a)和(b)的细胞活性结果也表明本文建立的胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶可以使细胞保持良好活性。

图6 HSF细胞在Col/Alg混合凝胶表面和凝胶内部的细胞活性及其在Col/Alg混合凝胶表面的迁移行为

Fig 6 Cell viability and cell migration behavior on the surface of Col/Alg hydrogel and in the Col/Alg hydrogel

2.6 细胞在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的迁移行为研究

采用激光共聚焦荧光显微镜观察HSF细胞在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的迁移行为。图6(c)结果表明，HSF细胞可以从胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面迁移至凝胶内部，再次表明胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面存在贯穿孔，并且其孔径大于HSF细胞大小。因此，本文制备的胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶作为可用于细胞迁移行为研究。

3 结 论

采用在海藻酸钠溶液中共混胶原溶液的方法，通过调节pH值与温度先引发胶原凝胶化，再向混合体系中引入钙离子引发海藻酸钠凝胶化，成功制备出胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶。通过红外光谱与圆二色光谱分析证实：该方法制备的凝胶体系中，胶原与海藻酸钙之间并没有发生相互作用，且很好保留了胶原的二级结构以保证其生物学功能的正常发挥。与传统的海藻酸钙水凝胶相比，胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶表面的疏水性增强，凝胶结构更为疏松，更利于细胞在凝胶表面的粘附与物质传递。以人源成纤维细胞为模型，通过考察细胞在凝胶表面与凝胶内部的形态学，进一步证实胶原分子在胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶的表面与内部均有分布，发挥细胞外基质功能。细胞迁移实验结果也表明该胶原/海藻酸钙互穿网络水凝胶不仅能有效保持细胞活性，且为细胞迁移行为的研究提供了一种新的研究模型。

[1] Haug A. Fraction of alginic acid[J]. Acta Chemica Scandinavica, 1959,13:601-603.

[2] Haug A, Smidsrod O. Fractionation of alginates by precipitation with calcium and magnesium ions[J]. Acta Chemica Scandinavica, 1965;19:1221-1226.

[3] Smidsrod O, Skjakbraek G.Alginate as immobilization matrix for cells[J]. Trends in Biotechnology, 1990,8:71-78.

[4] Lee B R, Hwang J W, Choi Y Y, et al. In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids[J]. Biomaterials, 2012,33:837-845.

[5] Jun Y, Kang A R, Lee J S, et al. 3D co-culturing model of primary pancreatic islets and hepatocytes in hybrid spheroid to overcome pancreatic cell shortage[J]. Biomaterials, 2013,34:3784-3794.

[6] Wu J, Wang G H, Zhang H, et al. Chondrogenicability of bone marrow mesenchymal stem cells in alginate and collagen sponge[J]. Key Engineering Materials, 2011,474-476:1935-1938.

[7] Kadler K E, Baldock C, Bella J, et al. Collagens at a glance[J]. Journal of Cell Science, 2007,120:1955-1958.

[8] da Cunha C B, Klumpers D D, Li W A, et al. Influence of the stiffness of three-dimensional alginate/collagen-I interpenetrating networks on fibroblast biology[J]. Biomaterials, 2014,35:8927-3936.

[9] Chaudhuri O, Koshy S T, Branco da Cunha C, et al. Extracellular matrix stiffness and composition jointly regulate the induction of malignant phenotypes in mammary epithelium[J]. Nature Materials, 2014,13:970-978.

[10] Liu Yun, Zhang Chuan, Zhang Chuanjie, et al. The effect of oxidation degree of oxidized starch on the properties of sodium alginate/gelatin IPNs crosslinked with oxidized starch[J]. Acta Polymerica Sinica,2015,4: 374-380.

刘 云, 张 川, 张传杰,等.氧化淀粉的氧化度对其交联海藻酸钠/明胶互穿网络膜性能的影响[J]. 高分子学报, 2015,4: 374-380.

[11] Ji Hu, Liu Yun, Zhao Jinchao, et al. The preparation and thermal properties of calcium alginate gelatin semi IPNs crosslinked with oxidized sodium alginate[J]. Journal of Functional Materials,2014,45(4): 4130-4133.

冀 虎, 刘 云, 赵瑾朝,等. 氧化海藻酸钠交联海藻酸钙/明胶(半)互穿网络的制备及热稳定性研究[J]. 功能材料, 2014,45(4): 4130-4133.

[12] Roy A, Bajpai A K, Bajpai J. Designing swellable beads of alginate and gelatin for controlled release of pesticide (cypermethrin)[J]. Journal of Macromolecular Science Part a-Pure and Applied Chemistry, 2009,46:847-859.

[13] Kanyas S, Aydin D, Kizilel R, et al. Nanoparticle andgelation stabilized functional composites of an ionic salt in a hydrophobic polymer matrix[J]. Plos One, 2014,9(2):e88125.

[14] Hu Y, Liu L, Gu Z, et al. Modification of collagen with a natural derived cross-linker, alginate dialdehyde[J]. Carbohydrate Polymers, 2014,102:324-332.

[15] Horii A, Wang X, Gelain F, et al. Biologicaldesigner self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration[J]. Plos One, 2007,2(2):e190.

[16] Kumada Y, Zhang S. Significant type Ⅰ and type Ⅲ collagen production from human periodontal ligament fibroblasts in 3D peptide scaffolds without extra growth factors[J]. Plos One, 2010,5(4):e10305.

Construction of collagen/alginate interpenetrating network hydrogel and influence of the hydrogel on cell behavior

SONG Yizhe1,3, REN Ying1,3, LOU Ruyun1,3, WANG Xiuli2, YU Weiting1, MA Xiaojun1

(1. Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, 457 Zhongshan Road, Dalian 116023, China;2. Department of Histology and Embryology, College of Basic Medical Science,Dalian Medical University, Dalian 116044, China 3. University of the Chinese Academy of Sciences, 19 Yuquan Road, Beijing 100049, China)

Methodologies to prepare alginate/collagen interpenetrating polymeric network (IPN) hydrogel were established by mixing sodium alginate and collagen together. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and the circular dichroism (CD) measurement indicate that the structure integrity of collagen is still maintained after the alginate treatment, while the analysis of water contact angle and SEM suggest that the hydrophobicity of the gels was improved and the structure of Col/Alg hydrogel was looser compared to pure calcium alginate gel, which was good for cell adhesion. HSF cells became well attached on the Col/Alg hydrogel and were elongated and spread out well in the Col/Alg hydrogel, which indicated that the collagen molecules existed in the surface and inner of the IPN hydrogel. Cell viability could be highly maintained in the Col/Alg hydrogel compartment, which will be a new mode to study the behavior of cell migration.

sodium alginate; collagen; interpenetrating polymeric network; physicochemical properties; cell behavior

1001-9731(2016)11-11136-05

国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2012CB720801)；国家自然科学基金资助项目(81173125)；中科院先导资助项目(XDA01030603)

2016-01-03

2016-04-20 通讯作者：王秀丽，E-mail: panpan1210@dicp.ac.cn，于炜婷

宋益哲 (1986-)，男，山东临清人，在读博士，师承马小军研究员，从事海藻酸/胶原-壳聚糖复合凝胶膜用于构建间接接触共培养体系研究。

O63-0；Q28

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.11.027