狐狸脑炎型链球菌的分离鉴定与药敏试验

秦绪伟 宋竹青



狐狸脑炎型链球菌的分离鉴定与药敏试验

秦绪伟 宋竹青

（齐鲁动物保健品有限公司 山东济南 250100）（山东省威海乳山市动物卫生监督所）

本试验从乳山一特种养殖场神经症状发病狐狸脑膜分离分离到一株致病性细菌，经一系列临床观察、实验室解剖、细菌分离、鉴定、生化试验确诊为肺炎链球菌，经动物实验确定该链球菌有一定的致病性，经药敏试验使用药敏敏感药物治疗，最终控制住病情。由于链球菌是环境常在菌，且有许多不致病，在防控和治疗上常被忽视，特别是链球菌引起瘫痪症状时，常被诊断为缺钙耽误治疗而死亡，本实验室是从神经症状狐狸脑分离到的细菌，有一定的疾病诊断意义和临床指导意义。

狐狸 链球菌神经症状瘫痪 鉴定

肺炎链球菌又称肺炎双球菌，是链球菌科、链球菌属的成员，链球菌属有18群30多种。链球菌在自然界中广泛分布，有的可以感染人，成为人兽共患病[1]，有的是脑炎球菌又称脑炎链球菌，属于革兰氏阳性球菌中链球菌属[2]，可引起各种动物的大叶性脑炎或者脑膜炎，亦可致幼兽脑炎或者败血症[3]，狐狸上发病有败血性、脑膜脑炎、心内膜炎、肺炎、关节炎[4]，临床上以肺炎型发病较多，脑炎会见到急性发病案例，肺炎球菌在多种健康动物的呼吸道、口腔黏膜可以分离到，一般不作为致病菌，只有条件恶劣机体抵抗力差的时候才会发病。

此次狐狸养殖场发生急性死亡、口吐白沫、角弓反张、瘫痪为主的病例，从狐狸脑膜分离到致病菌经诊断确诊为脑炎型肺炎链球菌病。开始以为是由于腺病毒引起的狐狸脑炎，经调查注射过狐狸脑炎疫苗，后经PCR检测排除病毒性脑炎病毒，确诊后经治疗恢复正常。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 来自于山东乳山一狐狸养殖场，养殖狐狸600只，50~70日龄狐狸分窝后零星发病，发病半月，死亡7只，主要症状口吐白沫、角弓反张、瘫痪，发病狐狸经解剖无菌条件分离脑膜，获得一株细菌，作为试验菌株。

1.1.2 试验动物 18~22g小白鼠7只，购自山东省实验动物中心；1.5~2.0kg家兔4只，购自济南西岭角养殖繁育中心；70日龄狐狸4只，购自章丘航科特种毛皮动物养殖场。

1.1.3 试验材料 营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、马丁肉汤、厌气肉肝汤等培养基等购自青岛海博生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司；胎牛血清购自济南劲牛生物科技有限公司；兔血清采自动物房实验健康兔；微量生化试剂管购自北京路桥技术有限责任公司； PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.4 试验器具 超净台、解剖台、天平、摇床、恒温培养箱、显微镜、研磨仪、解剖剪刀、酒精灯、接种环、烧杯、试管、平皿等其他实验室常规试剂。

1.2 方法

1.2.1 分离细菌的分离培养与镜检 无菌条件下打开发病狐狸的颅腔，切开后在血清营养琼脂涂抹，在37℃恒温培养箱培养18h~24h，观察细菌菌落，将分离菌单个接种于血清营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、鲜血平板，划线培养，37℃恒温培养箱培养18h~24h观察生长情况。取血清平板上典型的单个菌落，接种马丁肉汤培养基，37℃恒温培养箱培养18~24h，进行革兰氏染色，油镜镜检。

1.2.2 分离细菌的生化试验 将分离菌接种于加血清的马丁肉汤培养基，37℃恒温摇床震荡培养18~24h，取0.2ml细菌马丁肉汤液体培养液接种于乳糖、葡萄糖、麦芽糖、菊糖、棉实糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇成品微量生化反应管，吲哚、明胶试验，七叶苷，胆盐溶解实验，培养24~48h记录各种生化管的反应情况。

1.2.3 分离细菌的16S rRNA分子生物学鉴定 （1）细菌总DNA的提取：使用热裂解法快速提取细菌总DNA，取适当的菌悬液放入1.5ml无菌的离心管中，12000r/min离心1min，弃掉上清，将菌体重新悬于无菌水中，震荡摇匀后，沸水浴7min，冰浴5min，离心，上清液作为基因扩增的模板。（2）16S rRNA的扩增和测序：设计寡核苷酸引物来扩增16S rRNA，使用引物如下：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,R1-5’ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’。PCR反应体系50µl：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol/L)5µl，2.5mmol/L dNTP 4µl，引物(20umol/L)各1µl，模板2µl，ddH2O36.8µl，Taq酶(5U/µl)0.25µl。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 10min。取PCR产物5µl用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送交上海基因测序公司进行测序。（3）提交Genbank进行对比，构建系统发育树：采用Bioedit软件参照正反序列图谱对序列进行人工校对后，输入Genbank用Blastn软件进行相似性比较，并与Genbank中的相近序列和细菌模式菌株的16SrRNA序列用ClustalX1.83软件进行多重序列匹配分析，然后利用Mega软件构建系统发育树，用链接法获取分支发育树，系统发育树各分支的置信度经重抽样1000次重复检测，DNA序列变异中的转换和颠换赋予相同的加权值。（4）判定细菌的系统发育地位：16SrRNA以相似性97%为界限，以高于97%判定为该菌。

1.2.4 病料PCR检测 无菌取发病狐狸的肝、脾、脑，进行PCR检测，设计引物，检测有无腺病毒CAV。

1.2.5 分离细菌的药敏试验 接种环无菌取血清平板上的单个典型菌落，使用青霉素类、头孢类、喹诺酮类等药敏纸片法进行药敏实验，在血清平板上均匀涂抹，将标准化的药敏片贴在涂布细菌的平板上，37℃恒温培养箱培养24h，使用直尺测量抑菌圈的直径，观察细菌对各种药敏纸片的敏感程度，记录结果。

1.2.6 分离细菌的毒力试验 在无菌条件下使用接种环挑取典型的单个菌落，接种于加血清的马丁肉汤培养基，37℃恒温摇床震荡培养24h，细菌培养液100倍稀释后腹腔注射18~22g小白鼠，0.3ml/只共计5只，连对照组2只一起饲养，注射后观察7日。细菌培养液100倍稀释后腹腔注射1.5~2.0kg家兔，1ml/只，连对照组2只一起饲养，注射后观察7日。细菌培养液100倍稀释后腹腔注射70日龄狐狸，3ml/只，连对照组2只一起饲养，注射后观察7日。记录精神、饮食、粪便死亡情况。

2 结果与分析

2.1 细菌培养与镜检结果

分离菌在血清平板上生长良好，为密集的细小的露珠样透明菌落，兔鲜血琼脂平板可见灰白色细小菌落呈现明显的溶血环，麦康凯琼脂、SS琼脂不生长。在显微镜下观察，可见细菌较纯，染色呈现革兰氏阳性球菌，细菌呈矛头状，多两两成对，很少单个存在，也有的连接成4个或者双排。

2.2 细菌的生化结果

取0.2ml细菌马丁肉汤液体培养液接种于成品微量生化反应管，可见细菌分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、菊糖、棉实糖、海藻糖，不分解山梨醇、甘露醇，吲哚、明胶试验阴性，七叶苷阳性，胆盐溶解阳性，对照链球菌主要病原菌生化特性，确诊为肺炎链球菌。具体结果见表1。

表1 分离菌生化鉴定结果

注：“—”表示阴性，“+”表示阳性

2.3 细菌的分子生物学鉴定结果

根据上海测序公司的测序结果，采用Bioedit软件参照正反向序列图谱对序列进行人工校对，然后输入Genbank用Blastn软件进行相似性比较，最后利用构建系统发育树，与链球菌相似性为99.3%，最终确定为肺炎链球菌。

2.4 病料PCR检测结果

无菌取发病狐狸的肝、脾、脑，进行PCR检测，检测无腺病毒CAV。

2.5 细菌的药敏试验结果

使用药敏纸片法进行药敏试验，测量分离菌对各种药物的敏感性，通过抑菌圈的大小指导用药，检测可见头阿莫西林、青霉素、头孢噻呋钠、头孢喹肟钠、头孢哌酮钠、头孢噻呋钠、左氧氟沙星、强力霉素高敏，恩诺沙星、环丙沙星、壮观霉素、安普霉素中度敏感，粘杆菌素、阿米卡星、林可霉素低度敏感，新霉素、红霉素、阿奇霉素不敏感。具体药敏结果见表2。

表2 分离菌的药敏结果 (mm)

2.6 毒力试验结果

100倍稀释后的细菌培养液注射小白鼠第2天5只全部死亡，对照组观察7日，全部健活，死亡小白鼠心血分离到革兰氏阳性链球菌。100倍稀释后的细菌培养液注射小白鼠第2天2只全部死亡，对照组观察7日，全部健活，死亡家兔心血分离到革兰氏阳性链球菌。分离的脑炎链球菌有较强的毒力。两狐狸注射攻毒后第2天开始食欲减退，角弓反张，头向后背，前肢向前、后肢向后，有时头向一个方向弯曲转动，第3天见死亡，对照组观察7日正常。

3 讨论

3.1 脑炎链球菌的分离鉴定

发病狐狸在分窝断奶前一般50~70日龄，经大量调差养殖场，很多养殖场此段时间都有发病，查阅以往2009年~2015年解剖记录，每年5月~7月都有此种狐狸神经症状来诊断的客户，症状基本相同，角弓反张、瘫痪、食欲废绝，分离后共同的诊断结果都为双球菌。狐狸50日龄左右，正值狐狸从吃奶到吃料，自主活动的时间，各种器官发育不完全，容易受到外界环境的侵害，特别是一些环境致病菌，在机体发育不良的情况都容易发生。经解剖实验室培养，镜检可以确诊为链球菌，又经生化试验进一步确诊为肺炎双球菌。

3.2 脑炎链球菌的症状

狐狸脑炎型肺炎双球菌的主要症状是突然发病、食欲废绝、角弓反张、瘫痪，很多养殖场以为是病毒性的腺病毒引起的，特别是未免疫的养殖场都认为零星死亡是正常的，也不做预防和治疗，养殖场发病症状比较统一，大群精神食欲正常，一般1~2只前一天吃食完全正常，突然发病，神经症状，最后呼吸急促，全身瘫软死亡，发病后治疗一般无效，因为有细菌进入脑膜后很难治疗。

3.3 脑炎链球菌的诊断

多种细菌病毒都可以感染狐狸引起脑炎瘫痪神经症状，临床上首先区分是否为传染病，维生素B1缺乏也会引起瘫痪神经症状死亡，喹诺酮类药物使用过量也会引起瘫痪，缺钙也会引起瘫痪，需要鉴别诊断。病理性的腺病毒也会引起狐狸脑炎，有别于细菌性的脑炎，腺病毒需要注射狐狸脑炎疫苗，药物抗生素治疗一般无效，细菌性的也有侵脑型的大肠杆菌，需要进行药敏实验，确定哪种药物敏感才能进行治疗，有效的控制疾病。若为维生素B1缺乏、缺钙、喹诺酮类药物使用过量、腺病毒脑炎使用抗生素将耽误治疗，越用药越发病严重。此次病例发现后及时实验室诊断，通过镜检发现有革兰氏阳性链球菌，脑膜细菌分离阳性，经细菌分离、生化试验、16S rRNA确诊为肺炎链球菌。

3.4 脑炎链球菌的防治

脑炎链球菌现在没有有效的疫苗进行防疫，只能从加强饲料管理、注意环境卫生方面进行控制，不要饲喂变质污染的饲料，发病的死亡狐狸及时消毒深埋处理，全场消毒，建议断奶分窝狐狸胃肠较弱的时候都使用熟料，发病后及时诊断，及时采用敏感性高的药物进行预防治疗，有发病史的养殖场一般第二年还会发病，建议及时预防。本次病例，发病全群后每天使用聚维酮碘带动物消毒，肉食饲料全部熟制，玉米膨化，诊断后第二天开始投服敏感药物阿莫西林，出现发病的注射头孢噻呋钠，值45日龄左右的狐狸全部头孢注射预防，第3天发现两只，第4天发现一只，第5天开始未有新发病例，诊断后15d回访，养殖场恢复正常，有效的控制了疫情。

[1] 钱爱东. 兽医全攻略-毛皮动物疾病[M]. 北京: 中国农业出版社, 2009, 304-308.

[2] 周庭银. 临床微生物学诊断与图解第2版[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2006, 97-98.

[3] 陆承平. 兽医微生物学第5版[M]. 上海: 中国农业出版社, 2013, 83-90.

[3] 夏咸柱. 野生动物疫病学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011, 724-729.

（2016–06–21）

S852.61+1

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1007-1733(2016)09-0014-03