鸡霉形体的分离与药敏试验

王强 霍伟 任元刚



鸡霉形体的分离与药敏试验

王强 霍伟 任元刚

（山东省泰安市岱岳区山口镇畜牧兽医站 271038）（山东省泰安市岱岳区畜牧兽医局） （济南市商河县现代农业科技示范园管理委员会）

选择鸡毒霉形体的敏感药物，为临床防治用药提供理论依据。从鸡场分别取疑似患霉形体病的鸡进行血清学反应、病原分离培养和体外抑菌试验。经分离获得鸡毒霉形体12株，研究鸡毒霉形体对甲磺酸左旋氧氟沙星、阿齐霉素等12种抗生素的抗药性。结果表明，各种药物对毒霉形体的敏感程度不同。

鸡毒霉形体 培养基 平板凝集试验 药敏试验 甲磺酸左旋氧氟沙星

鸡霉形体病主要病原体为鸡毒霉形体、滑液霉形体和依阿华霉形体。被感染的鸡常表现为呼吸道症状，其特征为呼吸音异常、咳嗽、气管炎、气囊炎和流鼻液等。鸡毒霉形体常引起较严重的呼吸道疾病，且病程长，发病率高。由于该病在集约化养鸡场的普遍存在，给养禽业带来严重的威胁，因此如何有效地控制该病的发生已成为当前亟待解决的问题[1]。本试验对鸡毒霉形体进行分离培养和合理选用抗菌药防治鸡霉形体感染的研究对指导鸡霉形体病的诊断和合理用药有着重要的理论和实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验病鸡 疑似患霉形体感染的病鸡取我区32各中、小型鸡场，20~35日龄左右的商品肉鸡，每场抽取2例，共计62只。

1.1.2 主要试剂 （1）培养基制备试剂：霉形体肉汤基础培养基、猪血清、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I)、盐酸半胱氨酸、琼脂粉、青霉素、制霉菌素、去离子水(自制）。（2）普通化学试剂：氢氧化钠、盐酸、酚红。

1.1.3 鸡霉形体标准抗原、阴性血清和阳性血清 鸡毒霉形体平板凝集试验抗原，鸡阴性血清，MG-鸡毒支原体阳性血清。

1.1.4 药敏试验 药敏试纸片。

1.1.5 试验仪器 UPWS-IV-120D超纯水器、SW-WJ-LCU洁净工作台、PHS-3C精密PH计、FA2004N电子天平、电热鼓风干燥箱、420型电热恒温培养箱、YXQG02型电热式蒸汽消毒器、SA300PL普通光学显微镜、干燥器等。

1.2 试验方法

1.2.1 制备鸡霉形体固体和液体培养基[2,3]按规程操作。

1.2.2 鸡霉形体的分离培养及初步鉴定 （1）平板凝集试验[8]：采集疑似患鸡毒霉形体病的鸡血液。在鸡的翅静脉采血约2ml左右放入离心管中，直立凝血后，经1000r/min离心20min制得血清；取一块干净的玻板，划出3cm×3cm的方块，在每个方块滴一滴鸡毒霉形体平板凝集试验抗原，然后在抗原边滴一滴等量的待检鸡血清，用牙签将抗原与被检鸡血清充分混匀。同时设鸡毒霉形体阴性血清和鸡毒霉形体阳性血清对照。混合物在室温下2分中内出现凝集块者为阳性反应；无凝集块者为阴性反应。（2）鸡霉形体的分离培养：在超净工作台上剖检鸡毒霉形体平板凝集试验阳性的病鸡，用接种环钩取病变的气囊和支气管内容物接种于液体培养基中，同时直接接种于固体培养基，采用烛缸法进行培养。每天观察液体培养基的变色情况，观察培养液变色情况和浑浊度，有杂菌生长者弃去，无变化者每隔3d自传1代。当培养物中酚红变为橘黄色时，将变色后的液体培养基再划线接种到固体培养基平板上分离。接种完毕后，在皿底用记号笔作好序号和日期标记，平皿倒扣，放入干燥器中，点燃蜡烛，密封缸盖，置于恒温箱中37℃培养3~5d，观察菌落生长情况。直接接种的固体培养基也要每天观察菌落(显微镜4×10)，3d移植1次，病料至少培养观察20d，有杂菌生长的弃去。（3）分离纯化：将初步判定有霉形体生长的液体培养物划线接种到固体培养基平板上，培养3~5d，挑取显微镜下观察菌落呈“油煎蛋样”的单个菌落再次移植到固体培养基中培养。即可获得霉形体的纯培养物。否则重复分离培养，直至获得纯培养物。（4）分离菌鉴定：取霉形体48h液体培养物以2000r/min离心30min，弃上清，用生理盐水按100倍稀释菌体，作为抗原原液。取两滴自制抗原于载玻片上，一滴加鸡毒霉形体阴性血清做对照，另滴加一滴鸡毒霉形体阳性血清，充分混匀后判定结果，液滴中出现明显的粗颗粒者为阳性。

1.3 药敏试验

本试验采用药物纸片琼脂扩散法(纸片法)[5]。

1.3.1 菌液的配制 用接种环挑取纯化的鸡毒霉形体菌落1~2个，与5ml灭菌去离子水充分混合制成霉形体悬液。

1.3.2 菌液的涂布 取霉形体固体培养基平板，用灭菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。然后用拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次平板旋60度，最后沿平皿四周绕两圈，保证涂布均匀。

1.3.3 贴药敏纸片 待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴药敏纸片。用灭菌的眼科镊子取供试药敏纸片贴于琼脂平板表面，用镊尖轻压，使其贴平。纸片一旦贴上就不能再移动，纸片间距大于24mm，纸片中心距平皿边缘大于15mm。每贴完一张药敏纸片后镊子均在酒精灯上烧灼灭菌和破坏残留的抗菌药物。

1.3.4 培养 将贴有药敏片的平皿放入烛缸中。37℃恒温培养4~5d以上，观察抑菌直径。

1.3.5 结果判定标准 培养4~5d后取出平板，测量抑菌圈的直径大小。抑菌圈的边缘以肉眼看不到菌菌落明显生长为限。按照抑菌圈直径的大小判断鸡霉形体对药物的敏感性(如表1)。

表1 药物对霉形体抑菌效果的判定标准

2 试验结果及分析

2.1 鸡霉形体菌落形态

表2 鸡毒霉形体的分离结果 (只、个）

从鸡场采集的62只病鸡中，经分离获得鸡毒霉形体12株(如表2所示，同一患病鸡群分离的按一株计)。有鸡毒霉形体生长的培养基由红色变成淡黄色，培养4~5d的菌落肉眼观察白色呈露滴状，生长极为缓慢。在光学显微镜下观察，可见圆形“煎荷包蛋”样菌落，光滑、边缘整齐、具有一个颜色较深致密突起的中心，成乳头状，直径在0.2~0.3mm之间。

2.2 鸡霉形体药物敏感性

对分离获得的12株鸡毒霉形体分别用盐酸多西环素、硫酸庆大霉素、硫酸丁胺卡那霉素、酒石酸泰乐菌素、阿齐霉素、硫氰酸红霉素、磷酸替米考星、乳酸环丙沙星、甲磺酸左旋氧氟沙星、乳酸恩诺沙星、盐酸林可霉素和氟苯尼考进行药敏试验。甲磺酸左旋氧氟沙星对10株鸡毒霉形体的抑菌直径多在21~25mm之间，其高敏率达83.3%，中度敏感率为16.7%，无一株耐药；阿齐霉素对8株鸡毒霉形体的抑菌直径在12~18mm，即鸡毒霉形体对其中度敏感，敏感率为66.7%，耐药率为33.3%。乳酸恩诺沙星对9株鸡毒霉形体的抑菌直径在12~17mm，即鸡毒霉形体对其中度敏感，敏感率为75%，耐药率为25%。盐酸林可霉素、硫氰酸红霉素、酒石酸泰乐菌素、磷酸替米考星、盐酸多西环素、硫酸庆大霉素、硫酸丁胺卡那霉素、乳酸环丙沙星和氟苯尼考对12株鸡毒霉形体的抑菌直径多在0~12mm之间，即鸡毒霉形体对盐酸林可霉素、硫氰酸红霉素、酒石酸泰乐菌素、磷酸替米考星、盐酸多西环素、硫酸庆大霉素、硫酸丁胺卡那霉素、乳酸环丙沙星和氟苯尼考耐药。其抑菌结果见表3。

表3 鸡毒霉形体对药物的敏感情况 (%)

3 结论

（1）本试验采用青霉素和制霉菌素代替醋酸铊的鸡霉形体肉汤培养基成功分离培养出了鸡毒霉形体。（2）从鸡毒霉形体药物敏感性试验测定的结果看，岱岳区分离的12株鸡毒霉形体，对甲磺酸左旋氧氟沙星高度敏感，且高敏率达83.3%；对阿齐霉素和乳酸恩诺沙星中度敏感，敏感率分别为66.7%和75%；对盐酸林可霉素、硫氰酸红霉素、酒石酸泰乐菌素、磷酸替米考星、盐酸多西环素、硫酸庆大霉素、硫酸丁胺卡那霉素、乳酸环丙沙星和氟苯尼考耐药。

[1] 丁银巧, 乌尼, 郝永清等. 内蒙古地区鸡源霉形体的分离和鉴定[J]. 内蒙古农牧学院学报, 1998(1): 36-41.

[2] 姚火春. 兽医微生物试验指导(第2版) [M]. 北京: 中国农业出版社, 2002: 19-21.

[3] 郭锐. 鸡毒霉形体的分离鉴定及其16S/23SrRNA基因间隔区、TM-1基因序列差异分析[D]. 武汉: 华中农业大学, 2006: 35-42.

[4] 李凯伦, 崔玉苍. 猪鸡疫病免疫诊断技术[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2004: 485-486.

[5] 马兴树. 禽传染病实验诊断技术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2006: 105-122.

（2016–04–25）

S852.62

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1007-1733(2016)09-0011-02