危害凤尾菇生产的一种小包脚菇属草菇属物种的形态和分子鉴定*

张其坤，何晓兰，彭卫红**，陈　影，黄忠乾

（1．乐山市农业科学研究院，四川 乐山 614000；2．四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3．农业部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站，四川 成都 610066）

危害凤尾菇生产的一种小包脚菇属草菇属物种的形态和分子鉴定*

张其坤1，何晓兰2，3，彭卫红2，3**，陈影2，3，黄忠乾2，3

（1．乐山市农业科学研究院，四川 乐山 614000；2．四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3．农业部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站，四川 成都 610066）

近年来，在四川乐山地区凤尾菇（Pleurotus pulmonarius）栽培中，首次发现1种形态与草菇类似的大型真菌类污染菌。该菌在栽培场中的污染率可达60%以上，对凤尾菇的生产造成较大威胁。经初步鉴定为小包脚菇属（Volvariella）的木生小包脚菇 [Volvariella diplasia(Berk．&Broome)Singer]。该菌子实体形态与草菇类似，菌丝耐低温，可在4℃冰箱中保藏；原基形成和子实体发育温度范围广（13℃～33℃）；子实体丛生或单生，单粒种可达20 g以上，具有一定的开发价值。

凤尾菇；小包脚菇属；草菇；杂菌

2012年10月，我们在峨眉山市符溪镇黑桥村的栽培凤尾菇 [Pleurotus pulmonarius(Fr．)Quél．]的菇棚中发现1种影响凤尾菇生产，并可形成大型子实体的污染菌。因其子实体老熟后会发黑腐烂，菇农称其为“牛屎菌”，但与俗称的“牛屎菌”鬼伞明显不同。进一步的调查发现，该菌对乐山市凤尾菇生产有较大的威胁，危害严重地区污染率可达60%以上。2014年在四川沐川县、苏稽镇等地相继发现该菌的危害，并有蔓延的趋势。受到侵染后的凤尾菇菌袋产量显著下降，栽培效益明显降低。同时，该菌子实体形态与草菇类似，但形成子实体的温度范围较草菇广泛，似乎又具有一定的开发价值，为确定该杂菌的类型，发掘评价该类大型真菌的利用潜力，并为凤尾菇栽培防控该类杂菌的侵染奠定基础，本课题组对该菌进行了分离鉴定工作，现将结果报道如下。

1　材料和方法

1.1材料来源

样品采自峨眉山市符溪镇黑桥村，分离及形态观察的菌种采用PDA培养基培养。

1.2形态特征鉴定方法

对该杂菌新鲜子实体进行了拍照和宏观形态特征记录，并对分离菌种进行纯培养，子实体烘干后对其进行显微特征观察和描述。

1.3分子系统发育分析

采用基因组DNA提取方法，以子实体为材料，利用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.3.1ITS序列分析

采用真菌通用引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGG-3’）。反应体系为30 μL，该体系包括2× PCR Master Mix 15 μL，Primer（1 μmol·L-1） 各1μL；模板DNA 1 μL，ddH2O 12 μL。PCR扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，54℃退火l min，72℃延伸2 min，共计35个循环；循环结束后72℃延伸8 min。PCR扩增产物经克隆后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.3.2分子系统发育分析

运用Clustal[2]软件比对从GenBank下载小包脚菇属（Volvariella） ITS序列及本研究所得序列。以Pluteusromellii(Britzelm.)Sacc.和Pluteusatromarginatus(Konrad)Kühner作为外群，基于最大简约法，利用Paup软件构建小包脚菇属的系统发育关系[3]。

2　结果与分析

2.1病害的主要症状

该病害在凤尾菇菌袋满袋后的各个时期都可发生。在凤尾菇出菇前受到侵染时，菌袋菌丝生长纤细，浓白，满袋后15 d左右开始转淡；受害的菌袋较正常菌袋松软；该杂菌常在受害菌袋表面或袋口形成原基并逐渐发育形成子实体，并造成凤尾菇幼菇死亡；该菌在菇棚内形成子实体发生的温度范围广，13℃～33℃均可见子实体在菌袋上形成（图1）。当前仅见危害凤尾菇菌袋，未见危害邻近菇棚的平菇栽培袋。受到侵染后，凤尾菇原基形成受到影响，子实体生长缓慢，产量明显降低。在栽培大棚内污染率较高，可达60%以上。

图1　凤尾菇菌袋被危害症状及杂菌不同阶段子实体形态Fig.1　Symptoms of disease in Pleurotus pulmonarius cultivation and morphology of Volvariella diplasia fruiting body in diffferent phase

2.2形态及生物学特征

2.2.1学名

木生小包脚菇，Volvariella diplasia(Berk.& Broome)Singer,Lilloa 22:401(1951)，图2。

Agaricus diplasius Berk.&Broome,Trans.Linn. Soc.27:151(1870).

Volvaria diplasia(Berk.&Broome)Sacc.,Syll. fung.(Abellini)5:658(1887).

2.2.2特征

子实体丛生或单生；菇体颜色灰白至浅黄色，上有灰黑色斑（颜色深浅受光照强度与喷水影响）；蕾期紧实，菌肉白色，之后包膜顶端逐渐变薄，菌褶变为淡黄色，菌盖上出现披针状绒毛，颜色转为鹅毛黄；破膜后，包膜变为菌托，无菌环，伞状，菌柄中生；菌盖上有浓密的鹅毛黄披针状绒毛，长2mm～4 mm，菌肉白色，菌褶粉红色，菌柄实心，展开后菌盖直径可达16 cm；孢子印粉红色（图2b），菌褶延生（图2b）。

子实体出菇温度广，18℃～33℃均能出菇，调查发现可耐受13℃的低温，形成正常子实体；组织分离的菌丝在PDA培养基上生长正常，可在4℃左右冰箱中保藏，在1/2PDA培养基上菌丝稀疏（图2c），可形成子实体。

孢子 [（6.5） 7.0～8.5（9.5）]μm×（4.5～6.0）μm，光滑，椭圆形，浅褐色（图2a）。担子棒状，具4个担子小梗。褶缘囊状体宽棒状，无色透明，壁较薄。侧生囊状体较多，同褶缘囊状体。

图2　木生小包脚菇的孢子（a）、孢子印（b）及菌落形态（c）Fig.2　Morphological characteristics of spores（a）,spore print（b）and colony of Volvariella diplasia（c）

Volvariella diplasia是报道自斯里兰卡的1个木生的小包脚菇属种类，与银丝草菇V.bombycina (Schaeff.)P.Kumm.极为相似。

2.3分子系统发育分析

ITS序列已提交至GenBank保存。基于最大简约法，小包脚菇属系统发育树见图3。

图3　基于最大简约法小包脚菇属系统发育树Fig.3　Phylogenetic tree of Volvariella based on maximum parsimony method

ITS测序结果经blast比对，该菌与GenBank中来 自 欧 洲 鉴 定 为 V.bombycina（HM562212，EU920673.1） 的序列相似性为97%～98%，存在10个～16个碱基的差异；与GenBank中其他小包脚菇属相似性较低，这与形态学鉴定结果相吻合，确定该菌为木生小包脚菇（V.diplasia）。

分子系统发育分析结果显示，V.diplasia、V. bombycina和V.volvacea这三个种亲缘关系较近，聚于同一个分支，且支持率达100%。

3　讨论

Singer[5]曾注意到草菇V.volvacea的有些栽培品种通常是白色，许多研究者就将其作鉴定为木生小包脚菇V.diplasia；有文献也报道木生小包脚菇V. diplasia是印度1个重要的栽培种类，但这些文献中均记载其是草腐菌[6]，这与真正的木生小包脚菇V. diplasia木生的特点并不相符，可能印度记载的栽培木生小包脚菇 V.diplasia实质上也是草菇 V. volvacea。

对于该杂菌的来源，我们认为尽管各菌种厂家均没有生产与该菌类似的菌种，也不能排除因各种不明原因造成污染的可能性。凤尾菇栽培中出现的该杂菌感染可能来自凤尾菇菌种，由于在菌种生长阶段的检查不严，可能造成菌种带菌并污染。

2014年已相继在乐山市的沐川县幸福乡柏香村、市中区苏稽镇饶坎村等地发现同样的杂菌危害，并出现蔓延的趋势。主要危害凤尾菇菌袋，而对邻近的中高温型的平菇不造成危害。通过调查还发现，发生该菌为害的场地，菌袋配方均以木屑等为主料，似乎表明该菌趋向为1种木腐菌，而不是草腐菌，这也与V.diplasia木生的特点相符。

虽然目前木生小包脚菇V.diplasia对凤尾菇生产造成严重减产，但另一方面由于小包脚菇属有许多可食用的种类，初步的实验也证明木生小包脚菇V.diplasia无毒，可食用，且该菌与我国南方规模化栽培的草菇（V.volvacea）有明显差异，尤其是其对温度的敏感性不强，子实体形成温度范围广，适宜四川省夏季栽培，具有进一步开发利用价值。

[1]White TJ,Bruns T,Lee SS,et al．Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]//Innis MA,Gelfand DH,Sninsky JJ,White TJ(eds), PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications．New York:Academic Press,1990:315－322．

[2]Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,et al．The CLUSTAL X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]．Nucleic Acids Research,1997,25(24):4876－4882．

[3]Swofford DL．PAUP*:phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods)version 4．0b10[M]．Sunderland:Sinauer,2003．．

[4]Pegler DN．Agaric flora of Sri Lanka[M]．London:Kew Bulletin Additional Series,1986:519．

[5]Singer R．Mushrooms&truffles[M]．London:Leonard Hill, 1961a:272．

[6]Ahlawat OP,Kumar S,Arumuganathan T,et al．25 years of AICRP(mushroom)[M]．New Delhi:Yugantar Prakashan Pvt．Ltd．,2008．

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Identification of a Volvariella Species Which Hazard Pleurotus pulmonarius Cultivation

ZHANG Qi-kun1,HE Xiao-lan2,3,PENG Wei-hong2,3,CHEN Ying2,3,HUANG Zhong-qian2,3
(1．Leshan Academy of Agricultural Science,Leshan 610066,China;2．Soil and Fertilizer Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;3．Scientific Observing and Experimental Station of Agro－microbial Resource and Utilization in Southwest China,Ministry of Agriculture,Chengdu 610066,China)

In recent years,a species of Volvariella was found in the cultivation of Pleurotus pulmonarius,which infected P.pulmonarius up to 60%and caused seriously damage．It was identified as V.diplasia based on the morphology and molecular evidence．Volvariella diplasia resembles V.volvacea in morphology,while the mycelium of V.diplasia had low－temperature resistance character and could be deposited at 4℃．Its primordia formation and fruiting temperatures range was 13℃to 33℃,the basidiomata was gregarious or solitary,and one fruitbody weight was up to 20 g．V.diplasia could be a candidate for exploiting as edible mushroom．

Pleurotus pulmonarius;Volvariella spp．;Volvariella volvacea;mushroom disease

S646.9

A

1003-8310（2016）0106-0051-04

10．13629/j．cnki．53－1054．2016．06．012

四川食用菌创新团队资金资助项目（川农业函 [2014]91号）；四川省微生物资源共享平台建设（15010302）；西南地区作物秸秆基质化利用技术（201503137）。

张其坤（1967－），男，本科，高级农艺师，主要从事食用菌栽培技术研究。E－mail:qi0102kun＠163．com

**通信作者：彭卫红（1970－），女，硕士，研究员，主要从事食用菌遗传育种与病害防控研究。E－mail:pwh424＠163．com

2016－09－16