妇科千金片对盆腔炎大鼠TLR2/4-NF-κB信号通路影响的研究

袁建菱，李萍，文琦琪，刘丽，陈小丽，王艳

(湖南中医药大学,湖南长沙410208)

妇科千金片对盆腔炎大鼠TLR2/4-NF-κB信号通路影响的研究

袁建菱，李萍，文琦琪，刘丽，陈小丽，王艳

(湖南中医药大学,湖南长沙410208)

目的观察妇科千金片对盆腔炎大鼠子宫Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）、核转录因子kappaB（NF-κB）mRNA表达的影响,探讨妇科千金片调控TLR2/4-NF-κB信号通路对盆腔炎大鼠的抗炎机制。方法通过子宫注射混合菌液建立盆腔炎大鼠模型，将60只雌性SD大鼠随机分为5组,每组12只,即:空白组、假手术组、模型组、妇科千金片组、罗红霉素组，分别予以相应药物干预，运用免疫组化检测子宫组织中TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值；运用实时荧光定量PCR检测子宫组织中TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA表达变化。结果与空白组、假手术组比较，模型组的TLR2、TLR4、NF-κB灰度值显著降低（P＜0.01），TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表达均显著升高（P＜0.01），表明模型成功；与模型组比较，妇科千金片组、罗红霉素组TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均显著升高（P＜0.01），TLR2、TLR4、NF-κBmRNA均显著降低（P＜0.01）。结论妇科千金片对盆腔炎大鼠抗炎的作用机制，可能是通过调控TLR2/4-NF-κB炎性介质变化信号通路的传导而实现的。

妇科千金片；盆腔炎；Toll样受体2；Toll样受体4；核转录因子kappaB

妇科千金片是国家中药保护品种，由千斤拔、金樱根、穿心莲、单面针、十大功劳、鸡血藤、当归、党参组成，具有清热祛湿、补血益气的功效。近10年来研究发现妇科千金片具有抑菌、抗炎、镇痛、补益气血、提高免疫力等作用。研究表明：妇科千金片对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和白色念珠菌均有抑菌作用，对环磷酰胺所致免疫低下的小鼠，具有增加血清溶血抗体、提高细胞吞噬百分率和吞噬指数的作用[1]。本课题组前期研究显示：妇科千金片能提高机体免疫能力，调节炎症机体血清中细胞因子，促进Ig分子生成[2]，调节盆腔组织中炎性因子的表达，抑制核转录因子kappaB（NF-κB）所引起的级联反应，减轻机体组织炎症损伤[3]。

TLR2、TLR4在炎症反应中起着重要的信号转导作用，可通过TLR受体信号通路调控炎症免疫反应，从而达到调节炎症的目的[4]。由此可以提出以下假说：妇科千金片抑制TLR基因表达可以作为抗炎免疫的靶点，其机制是通过TLR2/4-NF-κB-信号通路调控炎性介质变化。

本研究在课题组以往临床、动物研究工作的基础上采用妇科千金片，以盆腔炎模型大鼠为受试对象，运用免疫组化和荧光定量PCR技术，从细胞和分子水平探讨妇科千金片对盆腔炎大鼠抗炎的作用机制，现将结果报道如下。

1　材料

1.1动物

SPF级成年雌性Sprague Dawley大鼠60只,体质量200～220 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:SYXK2013(湘)-0005。

1.2试剂与药物

PBS、BSA、SABC、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物工程有限公司）；TLR2、TLR4、NF-κB抗体（Proteintech公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德生物公司）；引物（南京金斯瑞公司）；TLR2、TLR4、NF-κB总RNA提取试剂盒（Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（vazyme公司）；PCR试剂盒（Fermentas公司）；妇科千金片：批号：201412054（株洲千金药业有限公司）；罗红霉素分散片：150 mg/片，批号：1502121（江苏神龙药业有限公司）。

1.3主要仪器

TGL16M台式高速冷冻离心机（湖南长沙市科威实业有限公司）；MIASE图像分析系统（北航公司）；紫外分光光度计（麦克奥迪实业集团有限公司）；480型DNA热循环仪（Perkin Elmer公司）；DYCP-31C型电泳仪（北京六一仪器）；7500荧光定量PCR仪（ApplidBiosystems公司）。

2　方法

2.1动物分组

将60只雌性SD大鼠,按照随机数字表分为5组,即:空白组、假手术组、模型组、妇科千金片组、罗红霉素组（西药对照组)，每组12只。

2.2造模方法[5]

除空白组与假手术组外，将实验大鼠分别称质量，腹部常规消毒，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部分别用碘伏和75%酒精消毒，下腹部正中切口约2 cm，暴露子宫，用1 mL注射器针头在子宫分叉处分别向左右两侧子宫向卵巢方向缓慢注入0.2 mL含3×109个/mL的混合菌液，注毕，分层缝合伤口，消毒术区。大鼠造模术后第4天随机分为妇科千金片组、罗红霉素组。按大鼠与人等效剂量换算方法计算出各大鼠给药剂量：妇科千金片组1.89 g/kg；罗红霉素组：罗红霉素82.74 mg/kg。各药均配成10 mL/kg给药溶液，每天定时经口灌胃给药治疗，每日1次,连续21 d。假手术组，手术操作同上，朝卵巢方向注射等量0.9%生理盐水，空白组不予任何处理。模型成功标准：采用HE染色,光镜下观察子宫组织病理改变情况,以确定造模是否成功。

2.3取材方法

大鼠给药治疗结束后的第2天清晨禁食，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。剖开腹腔后,取双侧子宫，一侧组织于10%中性甲醛固定于4℃保存，用于免疫组化检测；一侧组织放置于冻存管中，标号后存于-80℃冰箱中，用于Real-time PCR检测。

2.4检测方法

2.4.1免疫组化图像采集与分析把所截取的子宫进行石蜡包埋，制成厚约5μm的切片。操作应严格按照试剂盒说明书的步骤实施：（1）切片常规脱蜡至水化（步骤:每15 min用纯二甲苯清洗1次，共清洗2次；100%、95%、80%梯度酒精水化各5 min；自来水清洗5 min；每隔5 min蒸馏水清洗1次，共2次）；（2）将1份30%H2O2和10份蒸馏水倒入一起，室温下静置10 min，以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。热修复抗原：把切片放入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）后，用微波炉加热至沸腾3次，每次间隔5 min。冷却后PBS（PH7.2）洗涤2次；（3）加入5%的BSA封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗；（4）滴加适当稀释一抗大鼠TLR2、TLR4、NF-κB单克隆抗体（1∶100），37℃1 h。PBS（PH7.2）洗2分钟×3次；（5）滴加适量生物素化山羊抗兔IgG，37℃温箱20 min。PBS（PH7.2）洗2 min×3次；（6）滴加试剂SABC，37℃20 min。PBS（PH7.2）洗5 min×4次；（7）DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取试剂盒中A、B、C试剂各1滴,加入到1 mL蒸馏水中,摇匀后滴在切片上。

免疫组化图像分析所有图像均采用MIAPS医学图像分析系统进行分析，用阳性细胞的数量表示灰度值，再以灰度值来表示抗原的表达量。每个切片重复测量3次，然后取平均值进行统计。

2.4.2Real-time PCR法检测大鼠子宫组织TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表达Trizol提取细胞总RNA，操作步骤按试剂盒说明书执行，RNA纯度运用紫外分光光度计测定。引物在NCBI上搜索目的基因的序列，经Blast进行同源性分析，分析结果显示引物特异性好，无明显非特异性扩增。本实验用β-action作为内参照。（该引物及内参照β-action引物均委托南京金斯瑞合成，运用primer5.0软件设计）。NF-κB-F：GCTCACGTACATCTCAGAGGGTTGG，NF-κB-R：TCCTCATTCTCATCGGCTGCTTTT，产物长度：138 bp；TLR4-F：CATTGCTGCCAACATCATCC，TLR4-R：CCAGAGCGGCTACTCAGAAACT，产物长度：144bp；TLR2-F：TTCTCAATGGGTTCCAGCAAA，TLR2-R：ACGCAGTGAGTGGTGCAAGTAT，产物长度：102 bp；β-action-F：GAACGGGAAGCTGGTCATCAA，β-action-R：TGATGACCCTTTTGGCTCCG，产物长度：174 bp。PCR反应条件为：95℃10 min；95℃10 s，59℃50 s，读板，40个循环；熔解曲线60~95℃，结束反应。PCR仪器自动生成标准曲线和熔解曲线。

选择数据分析方式：本检测采用相对定量法检验基因的表达变化。本实验中目的基因与内参的扩增效率基本一致，故应用△△CT法进行相对定量分析。比较5组子宫中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表达量,以空白组子宫中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表达量作为标准对照。按照下列公式计算各组样本中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的相对表达量[6]。2-△△CT表示的是实验组目的基因的表达相对于空白组的变化倍数，△△CT=（目的基因CT值-内对照基因CT值）实验组-（目的基因CT值-内对照基因CT值）对照组，目的基因的相对含量=2-△△CT。

2.5统计方法

所有数据均输入计算机，用SPSS 17.0软件进行处理。各检测指标统计数据均以“±s”表示，组间两两比较若方差齐时选择LSD法，方差不齐时选择Tamhane法进行方差分析。

3　结果

3.1动物死亡情况

在实验过程中，共有8只大鼠死亡，其中3只死于麻醉意外，2只死于术后感染，3只在干预治疗过程中不明原因猝死。（空白组死亡1只，假手术组2只，模型组死亡2只，妇科千金片组2只，罗红霉素组1只)。

3.2妇科千金片对盆腔炎大鼠子宫TLR2、TLR4、NF-κB抗原活性的影响

与空白组、假手术组比较，模型组TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均显著降低（P＜0.01），与模型组比较，妇科千金片组、罗红霉素组TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均显著升高（P＜0.01），表明妇科千金片、罗红霉素均对盆腔炎大鼠具有一定的治疗作用；且妇科千金片组与罗红霉素组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），显示妇科千金片、罗红霉素对盆腔炎的疗效相当。见图1-3、表1。

图1　各组免疫组化TLR2表达光镜图（×200倍）

图2　各组免疫组化TLR4表达光镜图（×200倍）

图3　各组免疫组化NF-κB表达光镜图（×200倍）

3.3妇科千金片对盆腔炎大鼠子宫TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表达的影响

与空白组、假手术组比较，模型组TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表达均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，妇科千金片组、罗红霉素组TLR2、TLR4、NF-κBmRNA均显著降低（P＜0.01），表明妇科千金片、罗红霉素治疗药物均对盆腔炎大鼠子宫的TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表达具有一定下调作用；且妇科千金片组与罗红霉素组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），显示妇科千金片、罗红霉素对盆腔炎的疗效相当。见表2。

表1　各组大鼠子宫TLR2、TLR4、NF-κB表达的灰度值比较（±s）

表1　各组大鼠子宫TLR2、TLR4、NF-κB表达的灰度值比较（±s）

注：与空白组比较，#P＜0.05,##P＜0.01；与假手术组比较，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；与模型组比较，※※P＜0.01。

组别空白组假手术组模型组妇科千金组罗红霉素组F值P值n 11 10 10 10 11 TLR2灰度值179.50±22.15 164.95±9.34 82.21±6.34##▲▲145.27±4.81#▲※※139.53±7.64#▲※※8.59＜0.05 TLR4灰度值162.54±17.47 153.48±7.25 91.27±6.64##▲▲137.74±8.62#▲※※127.59±4.34#▲※※4.43＜0.05 NF-κB灰度值155.62±14.61 147.54±7.71 86.94±5.62##▲▲131.48±11.76#▲※※121.37±4.59#▲※※5.57＜0.05

表2　各组大鼠子宫TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表达的比较（±s）

表2　各组大鼠子宫TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表达的比较（±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与假手术组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，※※P＜0.01。

组别空白组假手术组模型组妇科千金组罗红霉素组F值P值n 11 10 10 10 11 TLR2mRNA 1.45±0.67 1.67±0.326 3.86±0.43##▲▲2.25±0.27##▲▲※※2.43±0.32##▲▲※※31.52＜0.01 TLR4mRNA 1.37±0.24 1.49±0.38 3.64±0.43##▲▲1.93±0.31##▲▲※※1.97±0.27##▲▲※※35.14＜0.01 NF-κBmRNA 1.24±0.23 1.49±0.16 2.98±0.26##▲▲2.21±0.32##▲▲※※2.14±0.29##▲▲※※36.98＜0.01

4　讨论

Toll样受体（TLR）首先在果蝇中发现。已经证实哺乳动物也存在TLR同源域,被命名为TLR家族。TLR是一组跨膜受体蛋白质,包括胞外丰富的亮氨酸序列和胞内与白介素-1（IL-1）受体信号域显著同源的尾状结构域,称为Toll/IL-1同源域。配体与TLR聚合活化后,接头蛋白髓样因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)与TLR胞内尾状结构结合,激活丝裂原激活蛋白激酶和NF-κB通路。这样,TLR介导的信号诱导了编码促炎因子的基因大量表达。目前为止，人类TLR家族有12名成员已被发现，其中以表达TLR4为主，尚有少量的TLR2。研究表明,TLR可能是细菌感染与炎症形成的一个桥梁,TLR在炎症形成中的信号通路有条主线：TLRNF-κB信号通路调控炎性介质变化[4]。

NF-κB作为一种普遍存在的转录因子，是多种信号转导途径的汇聚点，不仅参与介导了免疫应答病毒复制、细胞凋亡和增殖的多种基因的表达，而且在调节炎症反应的基因表达中起关键作用。已证实NF-κB可高效诱导多种细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α)、黏附分子(如ICAM1、VCAM1、ELAM1)、趋化因子和急性期反应蛋白的基因蛋白的基因表达，同时对参与炎症级联瀑布效应的多种酶的基因表达具有重要的调控作用[7]。

有研究[8-9]取三七提取物(含三七总皂苷和三七氨酸)进行治疗用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及消化性链球菌的混合菌液复制出恒河猴子宫内膜炎出血模型，发现三七复合有效成分可以抑制：阻断NF-κB的信号通路，降低TNF-αmRNA的表达，抑制炎性细胞因子TNF-α的生成。丁青[10-11]等用三七复合成分治疗子宫内膜炎患者，发现三七复合成分可以调节MMP-1和TIMP-1系统的平衡；有效降低炎症因子TNF-α、IL-1β的含量，降低NF-κB p65的转录及蛋白表达量，抑制NF-κB p65的核因子DNA结合活性。从而促进子宫内膜细胞炎症的修复，三七复合有效成分能促使炎症细胞转归，有效保护细菌脂多糖对培养细胞的损伤，有长效持续性保护细胞形态完整性功能。本课题组前期已研究证实，妇科千金片能改善盆腔炎大鼠盆腔组织的炎症病变，有保护盆腔组织作用[12-13]，减少细胞凋亡，降解细胞外基质抑制炎症反应[14]。

本实验通过免疫组化检测证实妇科千金片能使盆腔炎大鼠子宫的TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值显著升高，灰度值的高低与蛋白表达的强弱成反比关系，表明盆腔炎模型大鼠子宫的TLR2、TLR4、NF-κB表达水平显著降低。运用实时荧光定量PCR技术检测结果表明，妇科千金片对盆腔炎大鼠模型的干预，使TLR2/4-NF-κB信号通路中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表达明显下降，抑制了因NF-κB激活而产生的一系列炎症反应，从而表明妇科千金片对盆腔炎大鼠抗炎的作用，其机制可能是通过调控TLR2/4-NF-κB炎性介质变化信号通路的传导而实现的。

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（本文编辑 杨瑛）

Effect of Fuke Qianjin Tablets on TLR2/4-NF-κB Signaling Pathway in Pelvic Inflammatory Model Rats

YUAN Jianling,LI Ping,WEN Qiqi,LIU Li,CHEN Xiaoli,WANG Yan
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effect of Fuke Qianjin tablets on the expression of TLR2,TLR4,NF-κB in pelvic inflammatory model rats,and to investigate its anti-inflammatory mechanism of TLR2/4-NF-κB signaling pathway on the pelvic inflammatory rats.Methods The 60 female SD rats were injected with the mixture of the uterus to establish the model of the rats with pelvic inflammatory disease.Then the rats were randomly divided into 5 groups,12 rats in each group,namely:blank group,sham operation group,model group,Fuke Qianjin tablets group,roxithromycin group,which were given corresponding drug intervention.The gray values of TLR2,TLR4,NF-κB were detected by immunohistochemistry, and the expression of TLR2，TLR4,NF-κB mRNA of uterus was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Results Compared with the blank group,sham operation group,the gray values of TLR2,TLR4 and NF-κB in model group were decreased significantly(P＜0.01),the expression of TLR2,TLR4 and NF-κB mRNA were significantly increased(P＜0.01).Compared with the model group,the gray values of TLR2,TLR4 and NF-κB in Fuke Qianjin tablets group and roxithromycin group were significantly increased(P＜0.01),the TLR2,TLR4 and NF-κB mRNA were significantly lower(P＜0.01).Conclusion Mechanism of anti-inflammation of Fukeqianjin tablets on pelvic inflammatory model rats may be through the regulation of TLR2/4-NF-κB inflammatory medium signaling pathway.

Fukeqianjin tablets;pelvic inflammatory disease;TLR2;TLR4;NF-κB

R285.5；R271

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.11.004

2015-11-30

湖南省科技厅资助项目（2014SK3005）。

袁建菱，女，硕士，讲师，主要从事中药新药的研究与开发，E-mail：jly888666@163.com。