43例食管癌患者不同部位DNA聚合酶β基因检测临床分析

许兴和，曹 娟，宁召锋

(泰安市肿瘤医院，山东 泰安 271000)



43例食管癌患者不同部位DNA聚合酶β基因检测临床分析

许兴和，曹 娟，宁召锋

(泰安市肿瘤医院，山东 泰安 271000)

目的 比较观察食管癌患者不同分化程度癌组织、癌旁组织及正常食管黏膜组织中DNA聚合酶的表达差异。方法 采用RT-PCR检测方法对临床确诊并手术病理证实的43例食管癌患者进行癌组织、癌旁组织及正常食管黏膜组织进行polβ mRNA定量分析。结果 不同分化程度癌组织之间及癌旁组织中polβ mRNA表达水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，而正常食管黏膜组织中polβ mRNA表达水平均低于癌组织及癌旁组织(P均<0.05)。结论 食管癌中存在polβ基因启动子突变现象，且随距瘤体距离变化，polβ表达可能存在梯度差异。

食管癌；DNA聚合酶β；基因检测；RT-PCR

DNA聚合酶(DNA polβ)是哺乳动物细胞内主要的碱基切除修复酶，参与DNA损伤的修复，在体内正常情况下呈低表达，polβ异常表达的细胞显示碱基切除修复功能的缺乏及增加对碱基损伤物质的敏感性，也会增加抑癌基因、原癌基因等其他与控制生长有关的重要基因的突变频率，从而使肿瘤的发生概率升高。在人类前列腺癌、膀胱癌、肝癌、非小细胞肺癌及结直肠癌中都有DNA polβ基因突变[1]。食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，赵国强等[2]报道食管癌高发区河南省林州市食管癌组织中polβ基因突变情况，并报道突变率为36%。本课题组分析研究我院43例手术患者polβ基因突变情况，报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取我院2012年3月至2014年6月收治并确诊的食管癌患者43例，均经手术治疗，其中男29例，女14例；术后病理示高分化癌5例，中分化鳞癌22例，低分化鳞癌16例。组织选取癌组织、肿瘤边缘0.5 cm内组织、肿瘤切缘部分组织(正常食管黏膜组织)，肿瘤切缘严格按照肿瘤切除原则距肿瘤边缘>5 cm，且术后病理证实切缘阴性。组织切除标本离体后15 min内放入液氮中保存，标本均经山东省泰山医学院附属医院病理室检验证实。

1.2 主要试剂与仪器 Trizol试剂(德国QI-AGEN公司)；β-actin引物(上海宝莱生物科技技术有限公司)；PCR仪(德国Peqlab公司)；AMV、Taq酶、dNTP(美国Promega公司)；PCR引物(北京索莱宝科技有限公司)；PCR Marker(DL2000)(上海凯斯泰尔生物科技有限公司)；凝胶自动成像仪、水浴式电转印槽、电泳仪(美国Bio-Rad公司)；高速台式离心机、高速冷冻离心机(湖南湘立科学仪器厂家)；隔水式恒温培养箱(上海精宏有限公司)；稳压恒流电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.3 检测方法 polβ mRNA检测：1)总RNA的提取: 术中取得的新鲜病理组织,加液氮研碎,用总RNA提取试剂盒提取总RNA，将其溶于灭菌纯水中,用紫外分光分度计测定所取总RNA的浓度、纯度，琼脂糖电泳观察完整性；2)RT-PCR:AMV逆转录酶作用下完成逆转录，详细过程参考文献[3-4]；3)产物经凝胶成像系统(SYNGENE)分析,以目的基因/β-actin积分灰度值作为目的基因mRNA的相对表达量，根据正常黏膜表达水平推断若该比值>0.446 9为高表达，反之为低表达。合成引物的序列及PCR产物片段长度见表1。

表1 合成引物的序列及PCR产物片段长度

2 结果

采用RT-PCR检测方法对43例食管癌患者进行癌组织、癌旁组织及正常食管黏膜组织进行polβ mRNA定量分析，结果显示，不同分化程度癌组织之间及癌旁组织中polβ mRNA表达水平比较差异均无统计学意(P均>0.05)，而正常食管黏膜组织中polβ mRNA表达水平均低于癌组织及癌旁组织(P均<0.05)。见表2，图1、2。

表2 不同组织中polβ mRNA表达情况

图1 不同组织中polβ mRNA表达情况

图2 不同分化程度癌组织中polβ mRNA表达情况

3 讨论

我国是食管癌高发国家，全世界约50%的病例发生在中国，在我国，食管癌的死亡高居第4位，占全部恶性肿瘤死亡的16.05%，且发病率逐年上升[5-6]。

文献研究[2,7-9]发现，食管癌的发生是多因素、多阶段的复杂过程，在外界因素的持续影响刺激下，多种有害或有益的突变的相互作用达到机体损伤、修复的阈值时，将导致癌变发生。DNA polβ是一种DNA修复酶，广泛存在于细胞核内，是碱基切除修复系统中的核心成分，参与对DNA辐射损伤或化学损伤的修复合成，是哺乳动物体内复制保真度最低、最不精确的DNA聚合酶[10-12]。Jelezcova等[13]及Goellner等[14]各自团队研究指出高表达的polβ可能参与了肿瘤细胞的增殖并同时导致对一些抗肿瘤药物及射线的耐受。

鉴于大量关于polβ的高表达促进了肿瘤的起始、演进，并在肿瘤细胞耐药中可能发挥作用的报道，本文研究了polβ在食管组织中的表达情况，对比分析polβ在食管病变各阶段的水平，以期寻找差异，为食管癌早诊、早治提供参考依据。

本研究结果显示，polβ在癌组织、癌旁组织中的表达水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)，但明显高于正常食管黏膜组织(P均<0.05)。分析原因可能是：癌旁组织光镜下未见明显病理学改变却已存在分子基因水平的改变，其早于临床病理学出现，因而不能视为正常组织。提示polβ基因启动变异极有可能发生在食管癌癌变之前。这一区域是临床关注的焦点，可能为潜在癌变区，这些组织可能是造成恶性肿瘤局部复发的重要原因，意味着现行肿瘤切除边缘安全标准是否需进一步考证。赵四敏等[1]研究发现，食管不典型增生组织内已存在polβ突变，与癌组织及癌旁组织基本类同，但与正常食管黏膜组织存在显著差异，因本组所纳入患者未发现不典型增生存在，因而未行相关对比，但实际临床发现众多存在不典型增生的患者随访未出现癌变，其内可能存在更细微的差异，后续还需进一步深入研究，为不典型增生演化进展为食管癌提供参考指标。

总之，食管癌中存在polβ基因启动子突变现象，且随距瘤体距离变化，polβ表达可能存在梯度差异。

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许兴和(1976-)，男，主治医师，主要从事食管癌的临床诊断与治疗工作。E-mail：33756916@qq.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.023

R735.1

B

1673-5412(2016)05-0442-03

2016-01-22)