高效液相色谱法测定鳗鲡各组织中的乙酰甲喹残留量

潘 葳

(福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建 福州 350003)



高效液相色谱法测定鳗鲡各组织中的乙酰甲喹残留量

潘 葳

(福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建 福州 350003)

建立鳗鲡各组织中乙酰甲喹残留量的高效液相色谱测定方法，高效液相色谱检测条件为：采用SunFireTM C18柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)，柱温35℃；以甲醇∶水(40∶60，体积比)为流动相，流速为0.8 mL·min-1；采用二极管阵列检测器，检测波长239 nm。结果表明：在0.05 ～2.5 μg·mL-1范围内，乙酰甲喹具有良好的线性关系，含量与峰面积的相关系数达 0.999以上；乙酰甲喹在鳗鲡肌肉、肾、肝和血浆中的检出限分别为3 μg·kg-1、15 μg·kg-1、15 μg·kg-1、15 μg·L-1，鳗鲡各组织中乙酰甲喹回收率在76%～90%，相对标准偏差均小于10%(n=6)。本方法简便、快捷、灵敏度高，具有良好的重复性，满足鳗鲡各组织基质内乙酰甲喹残留量的快速定量分析的要求。

乙酰甲喹；鳗鲡；高效液相色谱；肌肉；肝；肾；血浆

乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)，又名痢菌净，是我国自主研发的一种新型兽药，属于喹噁啉-N-1,4-二氧化合物的衍生物，是一种广谱抗菌药[1]。其抗菌机理为抑制菌体的脱氧核糖核酸(DNA)合成，对仔猪黄痢和白痢、猪痢短螺旋体感染及鸡大肠杆菌病等均有较好的效果[2]。正是由于其对大多数细菌具有很强的抑制作用，且疗效好、见效快、安全性好、吸收良好，因此在养殖业中得到广泛的应用。但是，随着养殖户对于该兽药的滥用，乙酰甲喹在动物体内残留量超标导致的中毒事件时有发生[3]。乙酰甲喹毒性研究表明，其具有低至中度的急性毒性，并且对肝、肾和肾上腺具有损伤，此外还具有遗传毒性，对动物生殖能力和胎儿有一定抑制作用[4-6]。鳗鲡是一种降河性洄游鱼类，一般产于咸淡水交界海域[7-8]。在鳗鲡养殖过程中，易感染多种疾病，而乙酰甲喹则为常用的消炎药[9-10]，因此，监控鳗鲡体内乙酰甲喹的残留量，保证人类食用的安全性亦成为当今研究的热点。目前，针对动物体中乙酰甲喹的检测方法主要有高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)[11]和高效液相色谱法(HPLC)[12-15]。虽HPLC-MS/MS法灵敏度高，选择性强，稳定性好，但是其检测的操作复杂，成本也更高，而HPLC配紫外检测器的方法灵敏度亦能达到要求，更适用于乙酰甲喹含量的测定。用HPLC方法测定乙酰甲喹的方法很多，而针对鳗鲡各组织基质的研究却匮乏，为此本研究探索鳗鲡各组织中乙酰甲喹残留量测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

试验材料：美洲鳗鲡 (American eel)，由福建永泰海生源养鳗场提供；“空白样品”为不含乙酰甲喹的美洲鳗鲡样品；“给药样品”为口灌乙酰甲喹药品的美洲鳗鲡样品。

试验试剂：乙酰甲喹标准物质(中国兽药监察所，质量分数≥99.7%)，乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷(上海试剂总厂，分析纯)；甲醇(HPLC 级，TEDIA，美国)；试验用水由Milli-Q系统提供的二次水。

试验仪器：Waters2690高效液相色谱仪； Waters2996二极管阵列(PDA)检测器(或紫外检测器)；Millennium 32色谱工作站；TDL-40B台式离心机 (Anke公司，中国) ；AL204电子天平 (Mettler Toledo，瑞士) ；IKA-RV8旋转蒸发仪 (IKA公司，德国) ；KQ 250DB超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司，中国)；涡旋振荡器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，中国)。

1.2 色谱分析条件

色谱柱：SunFireTM C18柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)；柱温：35℃；流动相：甲醇∶水(40∶60，体积比)；流速：0.8 mL·min-1；二极管阵列检测器；紫外检测波长：239 nm；进样体积：20 μL。

在上述色谱条件下4种基质样品中乙酰甲喹与杂质得到快速有效分离，分离度大于1.5，乙酰甲喹色谱峰保留时间在4.4 min左右。

1.3 试液配制

标准储备液：精密称取乙酰甲喹标准样品0.01 g(精确到0.000 1 g)，用甲醇溶解并定容至100 mL，制成100 μg·mL-1标准溶液，4℃冰箱内保存。

标准工作液：准确移取0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、2.50 mL乙酰甲喹标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用流动相溶液稀释并定容至刻度，得到一系列的标准工作溶液(质量浓度分别为0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、2.50 μg·mL-1)，现配现用。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品制备 采用断尾取血法，将采集的血液置于含少量 1%肝素钠 (已风干)离心管中混匀，5 000 r·m i n-1离心 10 min，分离血浆。将肌肉、肝脏、肾脏匀浆。4种样品于-20℃保存待用。

1.4.2 提取 取出冷冻保存的样品。血浆自然解冻后准确移取0.5 mL上层血清于2 mL离心管中，鳗鲡肾、肝样品各自匀浆后分别称取0.50 g于2 mL离心管中，分别在上述离心管中加入二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液(二氯甲烷体积分数为75%)1.0 mL，旋涡振摇3 min和超声 3 min；鳗鲡肌肉样品匀浆后称取5 g(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中，加二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液20 mL，振摇混匀，超声提取15 min。将上述离心管中的样品4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液于另一洁净离心管或鸡心瓶中，残渣用混合提取液重复提取1次，合并提取液于离心管或鸡心瓶，浓缩近干，待净化。

1.4.3 净化

(1)血浆、肝脏 、肾脏：向蒸发至近干的离心管中加入0.50 mL流动相，旋涡振摇 2 min和超声 5 min溶解残留物，过0.2 μm微孔滤膜后，供液相色谱分析；(2)肌肉：向蒸发至近干的鸡心瓶中加入0.50 mL流动相，旋涡振摇 2 min和超声 5 min溶解残留物，重复以上操作，合并流动相溶解液至10 mL具塞离心管中，加入5 mL正己烷，旋涡混合1 min，4 000 r·min-1离心10 min，弃去上层正己烷，下层溶液过0.2 μm微孔滤膜后，供液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 液相色谱分析方法的优化

2.1.1 检测波长的确定 配制浓度为0.5 μg·mL-1的乙酰甲喹标准溶液，通过二极管阵列检测器采集乙酰甲喹标准溶液的3D图，并截取乙酰甲喹的紫外光谱图(图1)。从光谱图中可以看出：乙酰甲喹在239 nm和256 nm处吸收值远高于其他波长，但是通过比较研究发现256 nm波长的选择性不如239 nm，在239 nm处基质中无杂质对乙酰甲喹存在干扰，因此确定其为鳗鲡中乙酰甲喹的检测波长。

2.1.2 流动相的确定 色谱柱选择SunFireTM C18柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)，由于乙酰甲喹中有氢键作用力强的氧元素，因此选择甲醇和水作为流动相。考查纯甲醇作为流动相时色谱峰保留时间太短，目标物无法和杂质分离。在甲醇中增加水的比例，研究发现当流动相为甲醇∶水(40∶60，体积比)时，乙酰甲喹峰形良好，与4种样品的杂质均能得到快速有效分离，分离度大于1.5，乙酰甲喹色谱峰保留时间在4.4 min左右(图2)。

2.2 样品前处理条件的优化

本方法比较了二氯甲烷、乙酸乙酯及混合溶液对乙酰甲喹的提取效率，发现混合溶液比例为3∶1时提取效果最佳(图3)，因此选择提取溶剂为二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液(二氯甲烷体积分数为75%)。净化则采用的是正己烷去脂的原理，对样品进行净化。

2.3 线性范围和线性方程

取乙酰甲喹系列标准溶液(2.3)分别进样20 μL进行测定，以峰面积Y对乙酰甲喹质量浓度X进行线性回归分析，线性回归方程为Y=1.51×102X-6.36×103，相关系数r=0.999 3。结果表明：在0.05～2.5 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4 检出限定量限及定量计算

在空白鳗鲡肌肉、肾、肝和血浆中添加一定浓度的标准溶液，以信噪比(S/N≥3)确定各组分检出限(LOD)，信噪比(S/N≥10)确定各组分定量限(LOQ)，结果发现，当添加水平分别为0.015 μg·mL-1和0.05 μg·mL-1时，满足检出限和定量限的信噪比要求，结合不同组织的称样量和最终定容体积，确定本方法乙酰甲喹在鳗鲡肌肉、肾、肝和血浆中的LOD分别为3 μg·kg-1、15 μg·kg-1、15 μg·kg-1、15 μg·L-1， LOQ分别为：10、50、50、50 μg·L-1。

同时采用外标法定量计算样品中乙酰甲喹的含量，肌肉、肾、肝样品计算公式如下：

C=[(X·V)/m]×103

式中：C为样品中乙酰甲喹含量，肌肉、肾、肝样品单位为μg·kg-1；X为校正曲线中查得的乙酰甲喹含量，单位为μg·mL-1；V为样品最终定容体积，单位为mL；m为取样量，单位为g。

血浆样品计算公式如下：

C=[(X·V)/V取样]×103

式中：C为样品中乙酰甲喹含量，血浆单位为μg·L-1；X为校正曲线中查得的乙酰甲喹含量，单位为μg·mL-1；V为样品最终定容体积，单位为mL；V取样为取样体积，单位为mL。

2.5 回收率与日内精密度

选取不含乙酰甲喹残留的4种空白鳗鲡样品(图2-b、d、f 、h)，分别于0.05、0.10、1.00 μg·mL-13个水平进行加标回收试验，每个添加水平做6个平行，计算加标回收率和相对标准偏差，回收率和日内精密度结果见表1。各取一份供试材料，每隔2 d将样品测定1次，连续测定6次，计算日间精密度，结果见表1。在3个加标水平下，鳗鲡各组织中乙酰甲喹的回收率范围在76.4%～89.5%，日内精密度RSD(n=6)范围是3.21%～9.56%能满足鳗鲡中乙酰甲喹含量的测定。

表1 回收率试验结果

2.6 样品测定结果及日间精密度

本试验设定的条件下，测定了以口灌和浸浴2种方式给药后的美洲鳗鲡样品：各取一份口灌给药35 min后及浸浴给药15 min后的鳗鲡肌肉、肾、肝、血浆样品，每隔2 d将样品测定1次，连续测定6次，按照1.4对样品进行处理后上机测定，计算样品含量，鳗鲡肌肉、肝、肾及血浆中的乙酰甲喹与杂质峰均达到良好的分离，测得结果见表2，RSD值在2.69%～9.30%，说明本方法日间重现性良好。

表2 不同鳗鲡组织样品中乙酰甲喹残留量量及检测方法日间精密度

注：* 血浆样品乙酰甲喹含量单位为：μg·L-1

3 结 论

本研究建立了的高效液相色谱方法以测定鳗鲡各组织中乙酰甲喹残留量。样品经二氯甲烷∶乙酸乙酯(v/v 3∶1)混合溶液提取后，通过正己烷萃取净化，HPLC外标法进行定量。乙酰甲喹在0.05～2.5 μg·mL-1范围内线性关系良好，相关系数大于0.999。乙酰甲喹在鳗鲡肌肉、肾、肝和血浆中的检出限分别为3 μg·kg-1、15 μg·kg-1、30 μg·kg-1、 30 μg·L-1；定量限分别为：10 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1、100 μg·L-1，本方法灵敏度较山东省地方标准[12]提高了2倍。该山东省地方标准所用的流动相无法使鳗鲡4种组织中的杂质与目标物分离，而本方法所用的流动相鳗鲡各组织中的杂质都能与乙酰甲喹得到很好的分离。鳗鲡4种组织样品在0.05、0.10、1.00 μg·mL-13个添加水平上，回收率均大于75%，相对标准偏差均小于10%。本方法操作简便、成本低、灵敏度高、准确性好，有较好的重现性，能满足鳗鲡各组织中乙酰甲喹残留量的准确定量，为乙酰甲喹在鳗鲡各组织中的药代动力学研究奠定坚实的基础。

[1]刘桂兰, 夏雪林, 仝玉慧,等. 乙酰甲喹性质、毒性与替代药物[J]. 中国兽药杂志, 2011, 45(8):46-49.

[2]王旭, 程古月, 周秋格,等. 兽用喹噁啉类毒理学研究进展[J]. 中国农学通报, 2015，(17):16-21.

[3]刘迎春, 高怀涛. 乙酰甲喹的合理应用[J]. 养禽与禽病防治, 2009，(3):42-43.

[4]王旭, IHSAN AWAIS, 黄先菊,等. 乙酰甲喹的毒理学研究[C]. 湖北科技论坛论文集萃，2011.

[5]宋宗好, 提金凤, 李婧,等. 鸡乙酰甲喹中毒的诊断和防制[J]. 中国家禽, 2006, 28(13):41-42.

[6]赵秀举. 基于代谢组学及转录组学的乙酰甲喹毒作用研究[D].北京：中国科学院, 2011.

[7]樊海平. 我国鳗鲡养殖业的现状与发展对策[C].渔业对外贸易跟踪研究研讨会论文集， 2006.

[8]樊海平. 养殖鳗鲡新疾病及其控制技术[J]. 科学养鱼, 2007，(7):49-50.

[9]AOYAMA J, NISHIDA M, TSUKAMOTO K. Molecular Phylogeny and Evolution of the Freshwater Eel, Genus Anguilla[J]. Molecular Phylogenetics & Evolution, 2001, 20(3):450-459.

[10]李璐璐, 骆延波, 刘玉庆. 乙酰甲喹和喹烯酮药动学研究进展[J]. 中国抗生素杂志, 2016, 41(2)：98-103.

[11]杨涛. GPC-HPLC-MS/MS法同时检测动物源食品中3种兽药残留[J]. 广州化工, 2013, 41(14):142-144.

[12]周艳飞, 李浛, 王亚芳. HPLC法测定乙酰甲喹和喹乙醇的方法研究[J]. 饲料研究, 2013，(4):67-69.

[13]利光辉, 杨帆, 林燕茹,等. 超高效液相色谱法检测猪肉中乙酰甲喹及其主要代谢物[J]. 动物医学进展, 2013, 34(1):38-42.

[14]DING H, LIU Y, ZENG Z, et al. Pharmacokinetics of mequindox and one of its major metabolites in chickens after intravenous, intramuscular and oral administration[J]. Research in Veterinary Science, 2012, 93(1):374-377.

[15]DB37/T 2095-2012, 水产品中乙酰甲喹残留量的测定液相色谱法[S]. 山东：山东省地方标准, 2012.

(责任编辑：柯文辉)

HPLC Analysis on Mequindox Residues in Tissues of Eel

PAN Wei

(InstituteofQualityStandardsandTestingTechnologyforAgro-Products,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianKeyLaboratoryofPrecisionMeasurementofAgriculture,Fuzhou,Fujian350003,China)

An HPLC methodology was developed for determining mequindox residues in the organs of eels.The analysis was conducted under the following conditions: SunFireTM C18column (4.6 mm×150 mm,3.5 μm) at 35℃, methanol:deionized water (v/v 40∶60) for themobile phase with a flow rate of 0.8 mL·min-1, and 239 nm wavelength seton PDA detector for optical density measurements. With in the mequindox concentration range of 0.05-2.5 μg·mL-1, an excellent linear regression between the drug concentration and the peak area under curve was obtained with a correlation coefficient greater than 0.999.LODs of mequindox in the muscle, liver, kidney, and plasma from the eelswere 3 μg·kg-1, 15μg·kg-1, 15 μg·kg-1, and 15 μg·L-1, respectively. The average mequindox recovery rate of the method ranged from 76% to 90% with RSD (n=6) below 10%. It was, thus, concluded that the newly developed simple, rapidmethodology was highly sensitive and repeatable in detecting mequindox residuein the tissues of the eels.

mequindox; eel; HPLC; muscle; liver; kidney; plasma

2016-04-12初稿；2016-05-20修改稿

潘葳(1970-)，女，副研究员，主要从事农产品质量安全与检测技术研究(E-mail:will-pan@sohu.com)

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1025-3)

S 816

A

1008-0384(2016)08-853-05

潘葳.高效液相色谱法测定鳗鲡各组织中的乙酰甲喹残留量[J].福建农业学报，2016，31(8)：853-857.

PAN W.HPLC Analysis on Mequindox Residues in Tissues of Eel[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：853-857.